呂 妍， 賈少杰， 戴好富， 解修超， 曾艷波

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室， 海南 海口 571101；3.中國熱帶農業(yè)科學院 熱帶生物技術研究所， 海南 ?？?571101)

植物內生真菌是指在植物寄主中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌[1]。近年來人們對它的研究逐漸深入。植物內生真菌代謝產生結構新穎、生物活性較好的化合物總數(shù)遠高于土壤微生物[2]，這主要是因為植物內生真菌種類和數(shù)量多、生存環(huán)境多樣化。它的次生代謝產物普遍具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及抗心血管疾病等活性[3]。1929年，從青霉屬(Penicillium)真菌中分離出對多種病原菌具有極強抑制作用的化合物青霉素開始，人們對青霉屬真菌的研究從未停止。青霉屬是一類主要營腐生生活的較為多樣和常見的真菌[4]。目前，從青霉屬真菌中已經(jīng)分離出1300種不同的代謝產物[5]。本研究是從青霉屬植物內生真菌Penicilliumtropicum(KU641695)中分離純化出5個化合物，鑒定其結構，并對抑菌活性進行測試。

1 實驗器材

1.1 實驗儀器、試劑

核磁共振儀Bruker AV-500 (Bruker,German)；柱層析硅膠(Qingdao Haiyang Chemical Co.,Ltd.)；薄層層析硅膠板GF254(Qingdao Haiyang Chemical Co.,Ltd.)；20～45 μm ODS(Fuji Silysia Chemical Co.,Ltd.)；Sephadext LH-20(Merck Co.Ltd.)；薄層層析硅膠H(Qingdao Haiyang Chemical Co.,Ltd.)；馬鈴薯葡糖液體培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、pH自然)；大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基(大米100.0 g、水150.0 mL、pH自然)；實驗所用試劑均為市售分析純。

1.2 實驗菌株

植物內生真菌Penicilliumtropicum分離自植物Sapiumellipticum的新鮮葉片、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)?，F(xiàn)保藏于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所B502室。

2 實驗方法

2.1 內生真菌的發(fā)酵

以大米固體培養(yǎng)基對目標菌種進行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。待馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)中長滿菌絲球時，在無菌操作臺中，用5.0 mL移液槍吸取10.0 mL種子液接入大米固體培養(yǎng)基中(已滅菌，每瓶大米用量100.0 g)，接40瓶，室溫下靜置培養(yǎng)35 d。將接有內生真菌種子液的40瓶大米固體培養(yǎng)基，在無菌環(huán)境中，28 ℃靜置培養(yǎng)，期間每隔2 d觀察真菌菌絲體生長情況，有無污染。35 d后菌絲體均勻分布于大米表面且長透大米培養(yǎng)基，發(fā)酵結束。

2.2 代謝產物的提取與分離

真菌固體發(fā)酵結束后，使用乙酸乙酯過夜浸泡發(fā)酵物(每個三角瓶中加入400.0 mL)，超聲30 min，過濾并收集濾液，重復3次，合并濾液并減壓濃縮得到粗提物。向粗提物中加入適量蒸餾水溶解樣品，隨后加入等體積的乙酸乙酯，用分液漏斗連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取物，減壓濃縮至無溶劑味，得到乙酸乙酯萃取物56.5 g。將乙酸乙酯萃取物采用減壓柱(硅膠H)進行粗劃段，使用氯仿-甲醇為洗脫溶劑進行梯度洗脫，得到10個餾分Fr.A—J。Fr.C餾分經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜(甲醇)劃分為4個小餾分Fr.C1—C4，其中，F(xiàn)r.C1經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇，20∶1)得到單體化合物(1)；Fr.C3經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇，10∶1)和半制備高效液相色譜分離出化合物(2)；Fr.C4經(jīng)半制備高效液相色譜分離出化合物(3)；Fr.F經(jīng)葡聚糖凝膠(氯仿-甲醇，1∶1)，得到7個餾分Fr.F1—F7，F(xiàn)r.F3經(jīng)過(石油醚-氯仿，10∶1)分離得到化合物(4)；Fr.F5經(jīng)(石油醚-乙酸乙酯，10∶1)柱色譜和半制備高效液相色譜(C18色譜柱，甲醇-水，80∶20)得到化合物(5)。化合物(1)—(5)的結構如圖1所示。

圖1 化合物(1)—(5)的結構

2.3 抑菌活性測定

采用微量稀釋法測定樣品的抑菌活性。化合物溶于DMSO，母液濃度為2.56 mg/mL，用微量肉湯稀釋法測定化合物的最低抑菌濃度(MIC)。具體步驟如下：從新鮮活化的平板上挑取單克隆菌落至新鮮TSB培養(yǎng)基，于搖床37 ℃、250 rpm/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期；測定菌液OD值后，用MHB培養(yǎng)基稀釋至約5×105CFU/mL；稀釋好的菌液分裝至96孔板中，第一列每孔190.0 μL，其余每孔加100.0 μL；加化合物10.0 μL至第一列孔中，用排槍充分混勻后進行2倍倍比稀釋，使化合物濃度范圍在0.125～128.0 μg/mL；稀釋完成后，用封口膜封閉好96孔板，放置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h；24 h后觀察結果，記錄MIC值(最低抑菌濃度)，MIC以肉眼觀察時能夠完全抑制細菌生長所需的最低藥物濃度為準；以鹽酸萬古霉素作為陽性對照，同時包括DMSO生長對照、培養(yǎng)基對照。

3 實驗結果及活性測試

3.1 菌株的代謝產物

化合物(1)：無色針狀結晶，溶于氯仿；分子式C28H39NO，ESI-MSm/z:406[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.39(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),7.31(1H,d,J=8.0 Hz,H-8),7.08(1H,d,J=2.1 Hz,H-2),7.03(1H,t,J=7.5 Hz,H-7),6.97(1H,t,J=7.4 Hz,H-6),4.82(1H,d,J=1.8Hz,H-25),4.65(1H,brs,H-19),4.59(1H,brs,H-25),3.60(1H,dd,J=13.0,5.2 Hz,H-10),3.13(1H,dt,J=12.6,5.8 Hz,H-23),2.48(1H,m,H-12),2.07(1H,m,H-21),2.06(1H,m,H-16),2.01(1H,m,H-18),1.86(1H,dq,J=13.2,4.6 Hz,H-22),1.74(1H,m,H-18),1,74(H,m,H-17),1.64(1H,dt,J=13.1,4.6 Hz,H-21),1.57(1H,m,H-22),1.54(1H,m,H-13),1.49(1H,m,H-14),1.46(3H,s,H-26),1.25(1H,m,H-17),1.22(3H,d,J=7.0 Hz,H-27),1.21(1H,m,H-12),1.09(1H,d,J=13.7 Hz,H-14),0.92(3H,s,H-29),0.81(1H,d,J=13.2 Hz,H-13);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):123.4(C-2),114.8(C-3),127.0(C-4),117.4(C-5),118.2(C-6),120.6(C-7),111.5(C-8),135.9(C-9),34.0(C-10),38.1(C-11),31.0(C-12),30.1(C-13),27.9(C-14),38.9(C-15),29.4(C-16),25.3(C-17),28.7(C-18),66.2(C-19),43.4(C-20),24.2(C-21),27.1(C-22),42.8(C-23),150.0(C-24),111.0(C-25),18.2(C-26),21.6(C-27),15.9(C-28),18.2(C-29)。

以上化合物(1)波譜數(shù)據(jù)與Petersen L M等[6]報道的數(shù)據(jù)基本一致。因此，將化合物(1)鑒定為epi-10,23-dihydro-24,25-dehydroaflavinine。

化合物(2)：淡黃色固體，溶于甲醇；分子式C12H16O4，ESI-MSm/z:225[M+H]+;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ(ppm):5.60(1H,s,H-7),4.45(1H,m,H-3),3.98(1H,d,J=11.9 Hz,H-1),3.78(3H,s,H-13),3.54(1H,d,J=11.9 Hz,H-1),3.07(1H,dd,J=13.5,6.2 Hz,H-4),2.57(1H,brd,J=13.5 Hz,H-4),1.86(3H,d,J=1.4 Hz,H-12),1.12(3H,d,J=6.8 Hz,H-11);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ(ppm):188.6(C-6),176.5(C-8),149.2(C-10),131.0(C-5),101.9(C-7),72.9(C-3),70.2(C-9),70.1(C-1),56.7(C-13),33.4(C-4),16.4(C-11),10.8(C-12)。

以上化合物(2)數(shù)據(jù)與Zeng Y B等[7]報道的數(shù)據(jù)基本一致。因此，將化合物(2)鑒定為penitropone。

化合物(3)：黃色結晶，溶于氯仿；分子式C12H16O4，ESI-MSm/z:209[M+H]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ(ppm):6.23(1H,s,H-7),4.89(1H,d,J=15.1 Hz,H-1β),4.57(1H,d,J=15.1 Hz,H-1α),3.74(1H,m,H-3),3.68(3H,s,H-11),2.61(1H,brd,J=16.5 Hz,H-4β),2.43(1H,dd,J=16.7,10.6 Hz,H-4α),2.04(3H,s,H-10),1.38(3H,d,J=6.2 Hz,H-9);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ(ppm):64.8(C-1),70.8(C-3),34.2(C-4),134.2(C-4a),113.0(C-5),152.8(C-6),96.2(C-7),154.0(C-8),115.4(C-8a),21.8(C-9),10.2(C-10),55.2(C-11)。

以上化合物(3)數(shù)據(jù)與Smetanina O F等[8]報道的數(shù)據(jù)基本一致。因此，將化合物(3)鑒定為：(3S)-3,5-dimethyl-8-methoxy-3,4-dihydro-1H-isochromen-6-ol。

化合物(4)：淡黃色油狀，溶于氯仿；分子式C10H16O2,ESI-MSm/z:169[M+H]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ(ppm):6.86(1H,ddd,J=9.5,5.4,3.0 Hz,H-3),6.00(1H,ddd,J=9.8,2.0,1.5 Hz,H-2),4.41(1H,m,H-5),2.32(2H,m,H-4),1.78(1H,m,H-6),1.63(1H,m,H-6),1.51(1H,m,H-7),1.40(1H,m,H-7),1.31(2H,m,H-9),1.30(2H,m,H-8),0.88(3H,t,J=6.8 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ(ppm):164.8(C-1),145.2(C-3),121.6(C-2),78.2(C-5),35.0(C-6),31.6(C-8),29.5(C-4),24.6(C-7),22.6(C-9),14.1(C-10)。

以上化合物(4)波譜數(shù)據(jù)與Carosi L等[9]報道的數(shù)據(jù)基本一致。因此，將化合物(4)鑒定為：

(-)-massoialactone。

化合物(5)：黃色膏狀，溶于甲醇；分子式C16H30O9,ESI-MSm/z:367[M+H]+;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ(ppm):4.69(1H,m,H-3),4.66(1H,brs,H-1′),4.41(1H,m,H-5),3.87(1H,dd,J=11.8,2.4 Hz,H-6′),3.83(1H,d,J=3.3 Hz,H-2′),3.70(1H,dd,J=11.8,6.2 Hz,H-6′),3.53(1H,t,J=9.5 Hz,H-4′),3.45(1H,dd,J=9.5,3.2 Hz,H-3′),3.23(1H,ddd,J=9.1,6.3,2.2 Hz,H-5′),2.87(1H,ddd,J=18.0,3.2,1.8 Hz,H-2),2.77(1H,dd,J=17.9,4.9 Hz,H-2),2.15(1H,m,H-6),1.75(1H,m,H-6),1.65(1H,m,H-4),1.54(1H,m,H-7),1.44(1H,m,H-7),1.35(2H,m,H-8),1.35(2H,m,H-9),0.93(2H,t,J=6.8 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ(ppm):173.7(C-1),37.8(C-2),78.0(C-3),36.6(C-4),70.8(C-5),33.7(C-6),25.6(C-7),32.8(C-8),23.6(C-9),14.4(C-10),100.2(C-1′),72.7(C-2′),75.2(C-3′),68.5(C-4′),78.4(C-5′),62.9(C-6′)。

以上化合物(5)波譜數(shù)據(jù)與Dang Q L等[10]報道的數(shù)據(jù)基本一致。因此，將化合物(5)鑒定為：(3R,5R)-3-O-β-D-mannosyl-3,5dihydroxydecanoic acid。

3.2 抗菌活性檢測

采用微量稀釋法對化合物(1)—(5)的抑菌活性進行檢測，以鹽酸萬古霉素作為陽性對照(見表1)。化合物(1)對金黃色葡萄球菌USA300具有抑制活性，MIC為2.0 μg·mL-1，化合物(2)、(3)、(4)和(5)沒有抑制活性。

表1 化合物(1)—(5)對金黃色葡萄球菌USA300的抑制活性

4 結論討論

本研究從植物內生真菌Penicilliumtropicum的發(fā)酵產物中共分離鑒定5個化合物：epi-10,23-dihydro-24,25-dehydroaflavinine (1)、Penitropone (2)、(3S)-3,5-dimethyl-8-methoxy-3,4-dihydro-1H-isochromen-6-ol (3)、(-)-massoialactone (4)和(3R,5R)-3-O-β-D-mannosyl-3,5-dihydroxydecanoic acid (5)。并對以上5個化合物進行了抑菌活性測試，結果表明化合物(1)對金黃色葡萄球菌USA300具有抑制活性，MIC為2.0 μg·mL-1。化合物(1)為吲哚二萜類化合物，吲哚二萜類化合物具有多種生物活性，如殺蟲、抗MRSA、阻斷離子通道等[11]。因此，化合物(1)的生物活性值得更加深入的研究。