吳 浩，于浩楠，倪 華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

卵巢是雌性哺乳動(dòng)物重要的生殖器官之一，其主要功能是產(chǎn)生卵子和分泌類(lèi)固醇激素[1]。蛋白泛素化修飾屬于翻譯后修飾，受到該修飾的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞周期調(diào)控[2]、DNA 修復(fù)[3-4]、細(xì)胞凋亡[5]和癌癥發(fā)生[6-10]等一系列生理過(guò)程。有研究表明，泛素化參與卵巢生理過(guò)程，例如泛素連接酶CRL4 復(fù)合體可以維持卵母細(xì)胞的存活，在雌性生殖力維持中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。

蛋白泛素化由泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3 3 種酶共同完成[12]，其中E2 能夠控制泛素鏈的開(kāi)始和延長(zhǎng)轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)鏈形成和持續(xù)合成能力，從而決定泛素鏈的長(zhǎng)度和連接類(lèi)型，對(duì)泛素鏈的組裝起重要的調(diào)控作用[13-14]。泛素結(jié)合酶E2 S（Ubiquitin Conjugating Enzyme E2 S，Ube2s）是E2 家族成員。有研究表明，Ube2s介導(dǎo)K11 連接的多聚泛素鏈，參與DNA 損傷修復(fù)[4]；Ube2s延長(zhǎng)Ube2c 介導(dǎo)的泛素鏈，降解周期蛋白B1 促進(jìn)有絲分裂[15]，但Ube2s在卵巢中的表達(dá)及功能研究沒(méi)有報(bào)道。本研究以小鼠為動(dòng)物模型，利用原位雜交、免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，結(jié)合不同日齡小鼠卵巢發(fā)育模型、孕馬血清促性腺激素（PMSG）誘導(dǎo)卵泡發(fā)育模型、人絨毛膜促性腺激素（hCG）誘導(dǎo)的排卵模型和黃體形成與退化模型，研究Ube2s在小鼠卵巢組織中的表達(dá)變化，為闡明泛素化在卵巢生理過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中國(guó)昆明白色近交品系小鼠。人工控制條件下飼養(yǎng)，室溫23～25℃，光照周期為12 h 光照，12 h 黑暗，自由取食及飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

1.2.1 性成熟模型 分別選取1、5、10、15、20、25、30 日齡雌性小鼠，采集卵巢，每個(gè)日齡組6 只小鼠。

1.2.2 PMSG 誘導(dǎo)卵泡發(fā)育模型 選取21 日齡雌鼠，腹腔注射PMSG（5 IU/只），在注射PMSG 后的0、0.5、1、3、6、12、24、36、48 h 采集卵巢，并以21 日齡小鼠卵巢為對(duì)照，每組6 只小鼠。

1.2.3 hCG 誘導(dǎo)的排卵模型 選取21 日齡雌鼠，腹腔注射PMSG（5 IU/只）48 h 后注射hCG（5 IU/只），在注射hCG 后第0.5、1、3、5、7、9、11 小時(shí)采集卵巢，每組6 只小鼠。

1.2.4 hCG 誘導(dǎo)的黃體形成與退化模型 選取21 日齡雌鼠，腹腔注射PMSG（5 IU/只）48 h 后注射hCG（5 IU/只），在注射hCG 后第1、2、3、4、5、7、9、11、13、15天采集卵巢，每組6 只小鼠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠Ube2s基因片段克隆及探針的制備 根據(jù)GenBank 中小鼠Ube2s基因序列，設(shè)計(jì)上、下游引物（上游引物：5'-AATGTGCTCAAGAGGGACTG-3'，下游引物：5'-AGCTTCTTATCTCGCTCACC-3'）；以小鼠卵巢cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化產(chǎn)物后與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落搖菌，將菌液送交北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果BLAST 同源性比對(duì)，確認(rèn)Ube2s基因片段克隆正確后，利用DIG RNA labeling kit 試劑盒（Roche，11175025910 1 kit）進(jìn)行探針標(biāo)記。

1.3.2 原位雜交 將冰凍切片（10 μm）于4% 多聚甲醛（Sigma，P6148）中固定1 h，1% TritonX-100 溶液處理切片20 min，室溫下滴加預(yù)雜交液（5×檸檬酸鈉緩沖液（SSC），50% 甲酰胺）預(yù)雜交15 min；棄去預(yù)雜交液，后滴加雜交液（5×SSC，50% 甲酰胺，0.02% BSA，10% 硫酸葡聚糖，1 mg/mL 變性的地高辛標(biāo)記的Ube2sRN 探針）于55℃雜交16 h；將切片分別在含有5×SSC、2×SSC、0.2×SSC 的溶液中55℃搖床分別洗滌30 min；經(jīng)緩沖液Ⅰ（100 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5）平衡5 min 后，在1%Blocking solution 中封閉1 h。封閉后加堿性磷酸標(biāo)記的地高辛抗體（1:5000，Roche）4℃孵育過(guò)夜；切片洗滌后，再滴加顯色液（0.4 mmol/L 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，0.4 mmol/L 硝基四唑氮藍(lán)和2 mmol/L 左旋咪唑），避光顯色，出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)后，停止顯色；1%甲基綠復(fù)染，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 免疫組織化學(xué) 取小鼠卵巢組織經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋后，制成5 μm 切片；二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、0.01% 檸檬酸緩沖液修復(fù)、3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、10% 馬血清封閉后，加入U(xiǎn)be2s兔源抗體（Abcam，ab197945，1:200）4℃過(guò)夜；用Goat Anti-rabbit IgG/HRP（Abcam，ab6721，1:200）37℃孵育90 min；DAB 顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢并拍照。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取小鼠卵巢組織（30～40 mg）總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增；Ube2s（Ube2s序列號(hào)：NM-133777.2）引物序列：上游引物5'-AATGTGCTCAAGAGGGACTG-3'，下游引物5'-AGCTTCTTATCTCGCTCACC-3'，由北京擎科生物科技有限公司合成；10 μL 反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ0.2 μL，上、下游引物（10 mol/L）各0.2 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；使用 Amplied Biosystems?7500 Real-Time PCR System 操作，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用 GraphPad Prism 5.0 軟件繪圖并分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析或 Student's t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1Ube2s在性成熟小鼠卵巢中的表達(dá) 小鼠卵巢發(fā)育過(guò)程中，5 日齡小鼠卵巢中可以看到原始卵泡；10 日齡小鼠卵巢中出現(xiàn)初級(jí)卵泡；10、15 日齡小鼠卵巢中可以看到初級(jí)卵泡；25 日齡小鼠卵巢中出現(xiàn)次級(jí)卵泡；30 日齡的小鼠卵巢中各級(jí)卵泡都存在。

原位雜交結(jié)果顯示，Ube2smRNA 在原始卵泡的顆粒細(xì)胞中有表達(dá)（圖1-A）；隨著卵泡的發(fā)育，Ube2smRNA 在初級(jí)卵泡（圖1-B～C）和次級(jí)卵泡（圖1-D）的顆粒細(xì)胞中高表達(dá)；在有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量明顯降低（圖1-E）。Ube2smRNA 在原始卵泡和初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中高表達(dá)；隨著卵泡發(fā)育Ube2smRNA 在卵母細(xì)胞中的表達(dá)量水平逐漸降低（圖1-D～E）。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明Ube2s蛋白表達(dá)與mRNA 表達(dá)一致（圖1-G～I(xiàn)）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示（圖1-F），Ube2smRNA 在5、15、30 日齡的小鼠卵巢組織中表達(dá)水平逐漸下降（P＜0.05）。

2.2Ube2s在PMSG 誘導(dǎo)的小鼠卵泡發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)注射PMSG 1 h 后小鼠卵巢中大量卵泡開(kāi)始發(fā)育，注射PMSG 1、3、6 h 后小鼠卵巢中的卵泡可以看到次級(jí)卵泡；在注射PMSG 12 h 后，小鼠卵巢中出現(xiàn)有腔卵泡；注射PMSG 24、48 h 后小鼠卵巢中有腔卵泡的空腔逐漸變大。

原位雜交結(jié)果顯示，Ube2smRNA 在注射PMSG 1、3、6 h 后小鼠卵巢中次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，在次級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中低表達(dá)（圖2-A～C）；隨著注射PMSG 的時(shí)間延長(zhǎng)，Ube2smRNA 在注射PMSG 12、24、48 h 后的小鼠卵巢中有腔卵泡的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的表達(dá)逐漸減弱（圖2-D～F）。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，Ube2s蛋白表達(dá)與mRNA 表達(dá)一致（圖2-H～L）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示（圖2-G），Ube2smRNA 在注射PMSG 1、6、12、24、48 h 后的小鼠卵巢組織中表達(dá)水平逐漸下降（P＜0.05）。

2.3Ube2s在PMSG/hCG 誘導(dǎo)的小鼠成熟卵泡排卵過(guò)程中的表達(dá) 給21 日齡雌性小鼠注射PMSG/hCG 誘導(dǎo)排卵。注射hCG 0.5、5 h 后小鼠卵巢中卵泡出現(xiàn)三級(jí)卵泡，注射hCG 7、9、11 h 后，小鼠卵巢中卵泡出現(xiàn)成熟卵泡。

原位雜交結(jié)果顯示，注射hCG 0.5、5 h 后，Ube2smRNA 在三級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中表達(dá)弱（圖3-A～B），注射hCG 7、9、11 h 后，Ube2smRNA 在成熟卵泡的卵母細(xì)胞中表達(dá)很弱（圖3-C～E）。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)，Ube2s蛋白表達(dá)與mRNA 表達(dá)一致（圖3-G～J）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示（圖3-F），Ube2smRNA 在注射hCG 1、7、11 h 后的小鼠卵巢組織中表達(dá)水平逐漸減弱（P＜0.05）。

2.4Ube2s在黃體形成與退化過(guò)程中的表達(dá) 原位雜交結(jié)果顯示，注射hCG 12 h 后，成熟卵泡排卵，顆粒細(xì)胞黃體化。注射hCG 第1 天和第3 天后Ube2smRNA在新生黃體中強(qiáng)表達(dá)（圖4-A～B）；注射hCG 第4～11天后，Ube2s在黃體中的表達(dá)逐漸減弱（圖4-C～E），在注射hCG 第11 天黃體基本已經(jīng)退化，在退化的黃體中Ube2smRNA 表達(dá)水平變低。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，注射hCG 第1 天后在新生黃體中Ube2s蛋白表達(dá)強(qiáng)（圖4-G），注射hCG 第3～11 天后Ube2s在黃體中的表達(dá)逐漸減弱（圖4-H～J）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示（圖4-F），Ube2smRNA 在注射hCG 第1、7、11 天后小鼠卵巢組織中表達(dá)水平逐漸下降（P＜0.05）。

圖1 Ube2s 在性成熟前后小鼠卵巢中的表達(dá)

3 討 論

哺乳動(dòng)物的卵巢周期性進(jìn)行卵泡發(fā)育和黃體的形成與退化，卵泡發(fā)育主要包括卵泡中顆粒細(xì)胞增殖與分化和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)與成熟[16]；排卵后由殘存的顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞分化形成黃體，在未受精時(shí)黃體的正常退化又是下一輪生殖周期啟動(dòng)所必需的[17]。

本研究結(jié)果表明，在不同日齡的正常發(fā)育小鼠卵巢中，Ube2s在原始卵泡和初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中高表達(dá)，在次級(jí)卵泡和有腔卵泡的卵母細(xì)胞中表達(dá)降低。在PMSG 誘導(dǎo)的卵泡發(fā)育模型中，Ube2s的表達(dá)規(guī)律與在正常發(fā)育小鼠卵巢中的表達(dá)規(guī)律一致。Ben-Eliezer 等[18]在體外分離小鼠卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ube2s在小鼠卵母細(xì)胞中表達(dá)，并延長(zhǎng)后期促進(jìn)復(fù)合物APC/C（一種E3 連接酶）形成的泛素鏈作用于細(xì)胞周期蛋白B 促進(jìn)卵母細(xì)胞染色體分離，完成第一次減數(shù)分裂。本研究中Ube2s在卵泡的卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)規(guī)律性表達(dá)，并且在卵泡的卵母細(xì)胞發(fā)育的早期高表達(dá)。本研究結(jié)果與Ben-Eliezer 等[18]研究結(jié)果一致，提示Ube2s在小鼠卵泡的卵母細(xì)胞發(fā)育的早期參與更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

圖2 Ube2s 在小鼠卵泡發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

圖3 Ube2s 在小鼠成熟卵泡排卵過(guò)程中的表達(dá)

圖4 Ube2s 在黃體形成與退化過(guò)程中的表達(dá)

本研究結(jié)果表明，在正常發(fā)育小鼠卵巢中，Ube2s在原始卵泡的顆粒細(xì)胞檢測(cè)到表達(dá)；在初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞呈強(qiáng)表達(dá)；在有腔卵泡的顆粒細(xì)胞表達(dá)較低。PMSG 誘導(dǎo)的小鼠卵泡發(fā)育模型結(jié)果顯示Ube2s的表達(dá)規(guī)律與其表達(dá)規(guī)律一致。小鼠卵巢原始卵泡的顆粒細(xì)胞處于單層扁平狀，初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞處于快速增殖時(shí)期，Ube2s在此時(shí)呈強(qiáng)表達(dá)，提示Ube2s可能與顆粒細(xì)胞的增殖有關(guān)。有研究表明，Ube2s促進(jìn)多種細(xì)胞增殖，如在人乳腺癌細(xì)胞中，APC/C與Ube2c 催化形成泛素鏈，Ube2s可以延長(zhǎng)其泛素鏈，從而降解細(xì)胞周期蛋白B1 促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞有絲分裂[15]；在人肝癌細(xì)胞（HCC）中Ube2s高表達(dá)，促使p53 泛素化并降解從而促進(jìn)HCC 增殖[9]；在小鼠ES 細(xì)胞中Ube2s介導(dǎo)多聚泛素鏈形成，通過(guò)蛋白酶體介導(dǎo)Sox2 的降解從而增強(qiáng)ES 細(xì)胞的自我更新和多能狀態(tài)[19]。綜上推測(cè)，Ube2s通過(guò)泛素化修飾可能降解某種蛋白參與卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，為后續(xù)研究Ube2s在卵巢顆粒細(xì)胞中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

排卵后，由壁層顆粒細(xì)胞、內(nèi)膜細(xì)胞、外膜細(xì)胞和侵入的血管組織分化形成黃體[20]。本研究結(jié)果表明，Ube2s在注射hCG 后的第1～4 天黃體形成期的黃體細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)；在注射hCG 后的第7～15 天黃體退化期的黃體細(xì)胞中低表達(dá)。黃體形成期，黃體體積變大，黃體細(xì)胞增殖；退化時(shí)期黃體分泌孕酮下降，黃體組織被破壞，黃體體積變小。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ube2s在黃體細(xì)胞增殖時(shí)期高表達(dá)，并且有研究表明Ube2s促進(jìn)多種細(xì)胞增殖[7-11]，提示Ube2s可能參與黃體細(xì)胞的增殖以及參與形成具有分泌孕酮功能的黃體。綜上推測(cè)，Ube2s可能與黃體的形成與退化有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，Ube2s在小鼠卵泡發(fā)育和黃體形成與退化過(guò)程中呈規(guī)律性表達(dá)：Ube2s在小鼠原始卵泡和初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中呈強(qiáng)表達(dá)，在次級(jí)卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡的卵母細(xì)胞中表達(dá)逐漸減弱；Ube2s在原始卵泡的顆粒細(xì)胞中有表達(dá)，在初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中呈強(qiáng)表達(dá)，在有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中Ube2s表達(dá)變?nèi)酰崾綰be2s與卵泡發(fā)育有關(guān)。Ube2s在新生黃體中表達(dá)強(qiáng)，Ube2s在退化的黃體中表達(dá)逐漸降低，提示Ube2s與黃體的形成與退化有關(guān)。泛素化機(jī)制在卵巢功能的研究中剛剛起步，關(guān)于Ube2s在小鼠卵泡發(fā)育和黃體形成過(guò)程中表達(dá)的研究，可以作為研究卵巢發(fā)育過(guò)程中蛋白泛素化調(diào)控的切入點(diǎn)，為研究泛素化作用機(jī)制和卵巢生理機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。