劉文江，何玉強(qiáng)，周多恩，劉德武，孫寶麗，李耀坤，郭勇慶，鄧 銘，柳廣斌

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

人工授精技術(shù)在綿羊繁殖中的應(yīng)用多于山羊，主要是因?yàn)榫d羊人工授精技術(shù)研發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)且技術(shù)成熟。山羊與綿羊的精子生理特性不同，山羊精清中由尿道球腺分泌的卵黃凝固酶和SBU Ⅲ分別會(huì)與綿羊用卵黃精液稀釋液和乳汁稀釋液發(fā)生毒害作用以及強(qiáng)烈抑制山羊精子活力的反應(yīng)[1]，而且添加動(dòng)物源性蛋白也將提高感染風(fēng)險(xiǎn)[2]，因此不能直接將綿羊人工授精技術(shù)用于山羊，從而制約了山羊規(guī)?；B(yǎng)殖發(fā)展與優(yōu)秀山羊品種的培育。

稀釋液可擴(kuò)大精液配種量并短期保存精液，是影響山羊精子保存質(zhì)量的關(guān)鍵所在[3]。調(diào)整精液稀釋液配方能增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)、緩沖、抗菌、抗氧化和保護(hù)等作用。牛血清蛋白（BSA）是絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物精子的獲能物質(zhì)，可以阻止精子質(zhì)膜粘連[4]。一定濃度BSA 能提高低溫保存牛精子的生存能力[5]。已有使用大豆卵磷脂等非動(dòng)物源性物質(zhì)替代卵黃在稀釋液中作為其他動(dòng)物精子保護(hù)物質(zhì)的研究報(bào)道[6]，但這些添加劑在山羊精液稀釋液中的應(yīng)用仍需優(yōu)化。本研究擬利用BSA 及大豆卵磷脂從精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率及保存時(shí)間等指標(biāo)評(píng)價(jià)并改良現(xiàn)有基礎(chǔ)精液稀釋液常溫保存山羊精液的效果，以期提供一種山羊常溫精液稀釋液，為提高山羊配種效率及人工授精技術(shù)在山羊養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取廣東地區(qū)某種羊場(chǎng)健康且狀況相似的成年川中黑山羊公羊5 頭。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 水葡萄糖購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；果糖、檸檬酸鈉、EDTA、碳酸氫鈉、Hepes 均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；BSA 購(gòu)于北京Solarbio 公司；大豆卵磷脂購(gòu)于生工生物工程股份有限公司；青霉素、鏈霉素均購(gòu)于圣旺藥業(yè)股份有限公司；恩諾沙星、諾氟沙星均購(gòu)于華源藥業(yè)有限公司；慶大霉素購(gòu)于大連獸藥；卵黃在市場(chǎng)購(gòu)買；精子快速染色試劑盒由南京建成公司生產(chǎn)。

1.3 精液采集、檢測(cè) 利用假陰道法采集其精液后立即檢測(cè)，確保精液顏色和氣味正常，精子活力達(dá)到0.7 以上，密度在中等以上。檢測(cè)合格后混合并按精液與精液稀釋液1:4 的比例稀釋山羊精液，并從稀釋時(shí)刻起每隔12 h對(duì)精子的活力、精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率、存活時(shí)間及存活指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法均按GB 20557-2006標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[7]。將每份精液樣品每次制備于3 個(gè)玻片用于各指標(biāo)檢測(cè)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 基礎(chǔ)稀釋液的篩選 參考文獻(xiàn)[8-10]選擇6 種精液稀釋液配方作為候選基礎(chǔ)配方，稀釋液配方如表1 所示。從精子活力、有效存活時(shí)間、總存活時(shí)間以及生存指數(shù)比較6 種配方對(duì)山羊精子的保存效果，檢測(cè)方法同1.3。篩選效果最佳的一種作為本研究的基礎(chǔ)配方。

1.5 精液的稀釋方法 試驗(yàn)組首先在基礎(chǔ)稀釋液中分別添加0、1、2、3、4 g/L BSA，篩選BSA 最適添加濃度。再以所得最適BSA 添加濃度為基礎(chǔ)配制稀釋液，各試驗(yàn)組分別添加0、1、2、3 g/L 大豆卵磷脂，篩選最佳大豆卵磷脂濃度。檢測(cè)項(xiàng)均同1.4 并加上其對(duì)山羊精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率的影響，檢測(cè)方法同1.3。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用WPS2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分組整理，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)使用IBM SPSS Statistics 25 軟件中的單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，并采用Duncan′s 方法對(duì)各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。數(shù)據(jù)的可視化處理使用GraphPad Prism 8 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)稀釋液的篩選

2.1.1 精液稀釋液成分的差異對(duì)山羊精子活力的影響由圖1 可知，60 h 時(shí)，只有配方為E 和F 的精液稀釋液中的精子仍然存活。最終結(jié)果顯示E 配方稀釋液中的精子活力下降最少且速度最慢。

2.1.2 不同配方的精液稀釋液對(duì)山羊精子保存時(shí)間的影響 由圖2 可知，E 配方稀釋液組的有效存活時(shí)間、生存指數(shù)和總存活時(shí)間3 項(xiàng)指標(biāo)都顯著高于其他配方組。總體來(lái)看，采用E 配方的稀釋液保存效果最優(yōu)，因此選取E 配方作為用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)稀釋液。

2.2 BSA 對(duì)山羊精液保存效果的影響

2.2.1 BSA 對(duì)山羊精子活力和保存時(shí)間的影響 由圖3可知，添加不同濃度BSA 在0 h 開始就對(duì)精子存活產(chǎn)生了影響，添加BSA 可以提高精子的存活率（P＜0.05）。不添加BSA 和添加4 g/L BSA 組精液稀釋液中的精子在72 h 時(shí)全部死亡，而其他濃度梯度BSA 組中的精子依然具有活力，其中3 g/LBSA 組在各時(shí)間點(diǎn)的精子活力均高于其他組。由圖4 可得，稀釋液添加3 g/LBSA 時(shí)，精子的有效存活時(shí)間、總存活時(shí)間和生存指數(shù)都高于其他組（P＜0.05）。

表1 初選稀釋液配方

圖1 精液稀釋液成分的差異對(duì)山羊精子活力的影響

2.2.2 BSA 對(duì)山羊精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率的影響由圖5 可得，不添加BSA 和添加4 g/L BSA 組精液中的精子質(zhì)膜在72 h 時(shí)已經(jīng)沒(méi)有完整率，而其他濃度梯度BSA 組精液中的精子質(zhì)膜依然具有完整率，其中3 g/L BSA 組在0 h 之后各時(shí)間點(diǎn)的精子活率均高于其他組，提高了山羊精子質(zhì)膜的完整率（P＜0.05）。由圖6 可知，0 h 時(shí)間點(diǎn)開始，添加不同濃度BSA 就對(duì)山羊精子頂體完整率產(chǎn)生了影響。1 g/L BSA 組精液稀釋液中的精子在12 h 時(shí)頂體完整率最高；而在其他時(shí)間點(diǎn)，3 g/L BSA 組的精子頂體完整率均高于其他組。從整體來(lái)看，精液保存效果隨著BSA 濃度地增加呈先升后降的趨勢(shì)，其中以添加3 g/L BSA 效果最佳。

2.3 大豆卵磷脂對(duì)山羊精液保存效果的影響

2.3.1 大豆卵磷脂對(duì)山羊精子活力和保存時(shí)間的影響由圖7 可得，從0 h 時(shí)間點(diǎn)起，添加不同濃度大豆卵磷脂即對(duì)精子的存活產(chǎn)生了影響。2、3 g/L 大豆卵磷脂組精液稀釋液中的精子在72 h 時(shí)全部死亡，而其他實(shí)驗(yàn)組中的精子依然具有活率，其中1 g/L 大豆卵磷脂組在各時(shí)間點(diǎn)的精子活率均高于其他組。由圖8 可知，1 g/L大豆卵磷脂組被稀釋的精子的有效存活時(shí)間、總存活時(shí)間和生存指數(shù)均高于其他組（P＜0.05）。

圖2 不同配方對(duì)山羊精子保存時(shí)間的影響

圖3 BSA 對(duì)山羊精子活力的影響

圖4 BSA 對(duì)山羊精子保存時(shí)間的影響

2.3.2 大豆卵磷脂對(duì)山羊精子質(zhì)膜完整率的影響 由圖9可得，2、3 g/L 大豆卵磷脂組精液中的精子在72 h 時(shí)全部死亡，且在其他時(shí)間點(diǎn)的精子質(zhì)膜完整率低于另外兩組（P＜0.05）。而其他濃度梯度大豆卵磷脂組精液中的精子依然具有質(zhì)膜完整率，其中1 g/L 大豆卵磷脂組在各保存時(shí)間測(cè)定點(diǎn)的精子質(zhì)膜完整率都高于其他濃度組。由圖10 可得，添加了1 g/L 大豆卵磷脂組在各時(shí)間點(diǎn)的精子頂體完整率均高于其他組。

3 討 論

由6 種初選稀釋液配方的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，山羊精液使用配方E 配制的稀釋液保存效果最佳，F(xiàn) 次之。對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)組可知，前兩者除添加葡萄糖外，還等比例加入了果糖，其余4 種只加入單一種類的糖。曲宏偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在阿拉善型絨山羊精液稀釋液中混合添加葡萄糖與蔗糖2 種糖的實(shí)驗(yàn)組的精子保存效果顯著優(yōu)于添加單一蔗糖組；宣小龍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，按照接近于1:1比例添加2 種不同的單糖作為夏洛萊綿羊精液稀釋液營(yíng)養(yǎng)劑效果比只加入葡萄糖的更優(yōu)。蔗糖是非還原性二糖，是由一分子葡萄糖和一分子果糖在特定鍵位縮水而成，它被動(dòng)物體攝入后在相關(guān)特定酶的作用下被分解成兩分子葡萄糖參與供能或再被轉(zhuǎn)化為肝糖原肌糖原儲(chǔ)存在體內(nèi)。本研究與已有發(fā)表的研究結(jié)果相同，可能是等比添加的葡萄糖和果糖在為精子供能方面優(yōu)于添加單一的蔗糖，這有待更進(jìn)一步研究。

圖5 BSA 對(duì)山羊精子質(zhì)膜完整率的影響

圖6 BSA 對(duì)山羊精子頂體完整率的影響

圖7 大豆卵磷脂對(duì)山羊精子活力的影響

圖8 大豆卵磷脂對(duì)山羊精子保存時(shí)間的影響

圖9 大豆卵磷脂對(duì)山羊精子質(zhì)膜完整率的影響

圖10 大豆卵磷脂對(duì)山羊精子頂體完整率的影響

常溫條件下，在3 g/L BSA 與配方E 配制成的稀釋液中，山羊精子活力的保持狀況最好。Naijian 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍Tris 蛋黃稀釋劑中加入10 g/L 或15 g/L BSA 對(duì)于Mahabadi 山羊精子都有較好的保存效果。Uysal 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，添加20 g/L BSA 顯著提高了凍融Akkaraman 公羊精子的活力以及頂體與質(zhì)膜的完整性。Fu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在公豬精液中添加4 g/L BSA的精子活力比添加2 g/L BSA 的要高，但相同濃度的BSA 和脫脂奶對(duì)公豬精液的保護(hù)作用沒(méi)有顯著差異。本研究同樣證明，在精液稀釋液中添加適量的BSA 可延長(zhǎng)山羊精子的保存時(shí)間，然而本研究得出的最優(yōu)添加濃度與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的結(jié)果相異，這可能由基礎(chǔ)稀釋液配方和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種之間的差異導(dǎo)致。此外，添加4 g/L BSA 組的精子活力和保存時(shí)間低于其他組，說(shuō)明過(guò)高濃度的BSA 對(duì)山羊精子有害。并且結(jié)果還顯示，山羊精液稀釋液中的適量BSA 能降低山羊精子質(zhì)膜氧化損傷并提高其質(zhì)膜的完整率，而對(duì)山羊精子頂體卻沒(méi)有保護(hù)作用。可能是作為抗氧化劑的BSA 能夠降低精液中丙二醛（MDA）濃度，從而減少質(zhì)膜的過(guò)氧化[16]，并保持DNA 的高度完整[17]。

本研究結(jié)果顯示，在山羊精液稀釋液中添加大豆卵磷脂達(dá)到1 g/L 時(shí)，精子的活力與細(xì)胞膜的完整性顯著提高，精液的保存時(shí)間亦顯著增長(zhǎng)，但精子頂體完整率相對(duì)于其他濃度組并沒(méi)有顯著變化。當(dāng)稀釋液中大豆卵磷脂濃度達(dá)到2 g/L 或3 g/L 時(shí)，精子的活力下降增快、質(zhì)膜完整率下降。栗瑞蘭[18]研究發(fā)現(xiàn)，大豆卵磷脂濃度為1.5% 的精液稀釋液中的內(nèi)蒙古絨山羊精子DNA完整度最高，2.5% 組最低，之間的差異不明顯。孟娜娜[19]研究顯示，在4～5℃的保存溫度下，稀釋液中添加0.375%大豆卵磷脂綿羊精子保存的時(shí)效增強(qiáng)效果最好，但是大豆卵磷脂超過(guò)一定濃度后，精子的保存時(shí)間將隨其濃度增加而逐漸變短。這可能是大豆卵磷脂難溶于水，當(dāng)大豆卵磷脂濃度達(dá)到臨界值后，其溶解能力變小，使得稀釋精液變得黏稠，導(dǎo)致阻力增大，從而表現(xiàn)為精子能量消耗增高增快[20]。Akhter 等[21]和Singh 等[22]研究認(rèn)為，過(guò)高濃度的卵磷脂將影響精子正常運(yùn)動(dòng)，并且對(duì)精子的生存性能產(chǎn)生了相當(dāng)程度的不利影響。世界各地的大量研究都已經(jīng)證明，在含有大豆卵磷脂的精液稀釋液能提高精子的保存效果，但是各研究的具體結(jié)論都不盡相同。應(yīng)基于產(chǎn)品純度、生產(chǎn)批次、試驗(yàn)動(dòng)物和精液處理方式等因素的不同進(jìn)行針對(duì)性的調(diào)整才能得出具體的最佳添加濃度。

4 結(jié) 論

本研究在前人研究基礎(chǔ)上比較了不同濃度梯度BSA 及大豆卵磷脂對(duì)山羊精子的保護(hù)作用，并根據(jù)其作用優(yōu)化了山羊稀釋液的配方。結(jié)果顯示，在上述E 配方基礎(chǔ)稀釋液中添加3 g/L BSA、1 g/L 大豆卵磷脂的優(yōu)化稀釋液保存山羊精子的效果最佳。因此，每1 L 蒸餾水含有葡萄糖19 g、果糖19 g、檸檬酸二鈉16 g、EDTA-Na21.7 g、BSA 3 g 或大豆卵磷脂1 g、青霉素鈉和硫酸鏈霉素各100 萬(wàn)單位的常溫精液稀釋液，具有較好的山羊精子保存效果，最適合山羊人工授精使用。