易治鑫，李林祥，徐 進，李 苗，姜冬梅

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川成都 611130；2.巴中市農(nóng)林科學(xué)研究院，四川巴中 636000）

多胺（腐胺、亞精胺和精胺）在蛋白質(zhì)生物合成、細胞增殖、分化和凋亡過程均具有重要調(diào)控作用[1-3]，多胺還能作為抗癌和抑癌藥物的靶點[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，生殖激素對多胺代謝酶表達及其活性具有重要調(diào)控作用[7-9]，而多胺與激素受體之間也存在著某種復(fù)雜聯(lián)系。Kang等[1,10]研究發(fā)現(xiàn)，干擾OAZ1會抑制鵝顆粒細胞促黃體生成素受體（Luteinizing Hormone Receptor，LHR）基因表達，而過表達OAZ1則會促進促卵泡激素受體基因（Follicle Stimulating Hormone Receptor，F(xiàn)SHR）和LHR表達。龍詩韻等[11]研究發(fā)現(xiàn)，0.15 mg/g 亞精胺能促進小鼠卵巢FSHR表達，下調(diào)LHR表達。月經(jīng)周期的女性血漿雌二醇（E2）水平首次增加時伴隨精胺含量最高峰，而E2與其受體的識別受到多胺調(diào)控[2,12]。高濃度亞精胺能介導(dǎo)小鼠卵巢雌激素受體（Estradiol Receptor,ER）基因的表達調(diào)控卵巢功能[11]。干擾OAZ1后顆粒細胞ER1表達下調(diào)，而過表達OAZ1后ER1表達上調(diào)[1,10]，提示多胺或多胺代謝基因能調(diào)控激素受體基因的表達。綜上所訴，多胺或多胺代謝基因能介導(dǎo)生殖激素受體基因表達進而參與調(diào)控動物繁殖。然而，目前并不清楚外源性多胺是否會通過介導(dǎo)雌性動物生殖激素受體表達來參與調(diào)控動物性腺發(fā)育，同時尚未見有關(guān)多胺對早期性腺發(fā)育過程中性腺激素受體基因影響的報道。而近年來有研究表明精胺在雌性動物繁殖過程中具有重要調(diào)控作用[13-14]。因此，本研究用精胺灌胃雛鵝，探討精胺對發(fā)育早期雌鵝卵巢組織FSHR、LHR、ER1和ER2表達的影響，以期為多胺調(diào)控家禽繁殖功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集 選擇同批孵化、體況一致的28 日齡四川白鵝母鵝12 只。隨機分為對照組（灌胃禽用生理鹽水）和試驗組（按5 mg/kg 體重的灌胃劑量灌胃精胺，每只鵝每次灌胃量為300 μL，精胺用超純水溶解配制）。自由采食和飲水，每天于08:00 和20:00分別灌胃，連續(xù)灌胃2 周，分別于第8 天和第14 天進行稱重。灌胃結(jié)束后，采集翅靜脈血液5 mL 后頸部放血致死，迅速采集卵巢組織并稱重。血液樣品靜置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，收集血清。平均日增重=（結(jié)測體重－始測體重）/ 測定天數(shù)，卵巢指數(shù)（g/kg）=卵巢鮮重/活體重。

1.2 組織總RNA 提取與cDNA 模板制備 全部卵巢組織樣品總RNA 參照Trizol 試劑（TaKaRa，大連）操作說明書提取，分別取5 μL 總RNA 于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質(zhì)量。組織樣品cDNA 反轉(zhuǎn)錄參照M-MLV 試劑盒（TaKaRa，大連）操作說明進行，并置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實時熒光定量PCR 實時熒光定量反應(yīng)體系為50 μL：iQTM SYBR?Green Supremix（Bio-Rad，USA）25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，cDNA 模板2.0 μL，RNase Free H2O 19.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，依據(jù)表1 中引物退火溫度退火30 s，72℃延伸30 s（采集熒光），45 個循環(huán)；95℃ 10 s，60℃ 1 min，繪制熔解曲線。以GADPH作為內(nèi)參基因，按照上述實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)設(shè)置，定量檢測四川白鵝卵巢組織樣品中FSHR、LHR、ER1和ER2基因相對表達量，每個樣品設(shè)3 個重復(fù)。實時熒光定量PCR 引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.4 統(tǒng)計分析 根據(jù)熒光定量PCR 檢測的目的基因Ct值，利用Excel 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。采用2-ΔΔCt法計算得出卵巢組織中FHSR、LHR、ER1和ER2基因的相對表達量。應(yīng)用t 檢驗進行顯著性分析，顯著水準為α=0.05，結(jié)果表示為平均值±標準誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 精胺對鵝平均日增重和卵巢指數(shù)的影響 如圖1 所示，給雛鵝灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，灌胃精胺組雛鵝平均日增重與對照組相比無顯著差異。如圖2 所示，給雛鵝灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，灌胃精胺組卵巢重和卵巢指數(shù)與對照組相比均無顯著差異。

2.2 精胺對鵝卵巢FSHR、LHR、ER1和ER2基因表達的影響 如圖3 所示，給雛鵝灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，精胺處理組雛鵝卵巢組織中LHR和ER2表達量分別是對照組的4.78 倍和1.65 倍（P＜0.05）；而雛鵝卵巢組織中FSHR和ER1表達量與對照組相比無顯著差異。

圖1 精胺對鵝平均日增重的影響

圖2 精胺對鵝卵巢重（A）和卵巢指數(shù)(B)的影響

圖3 精胺對鵝卵巢FSHR、LHR、ER1 和ER2 基因表達量

3 討 論

生殖激素促進性腺發(fā)育和調(diào)控繁殖的功能需要通過受體識別和結(jié)合才能實現(xiàn)，而卵巢生殖激素受體的表達變化則會影響生殖激素的作用效應(yīng)。與FSH 結(jié)合并產(chǎn)生效應(yīng)的FSHR 主要分布于卵巢組織中，與卵母細胞的發(fā)育和成熟有關(guān)[15]；有研究認為，卵巢和卵泡中FSHR基因的表達量可能與家禽的性早熟有關(guān)[16]，提示FSHR基因能參與調(diào)控家禽性腺早期發(fā)育。本實驗中，雛鵝灌胃2 周精胺后，鵝卵巢FSHR基因表達與對照組無顯著差異，與上述研究結(jié)果不一致，推測在體成熟前雛鵝性腺發(fā)育相較遲緩，卵巢維持FSHR水平可能與機體為避免性早熟有關(guān)，這一推測還有待進一步研究證實。

Thyssen 等[17]研究發(fā)現(xiàn)外源性多胺能抑制促黃體生成素（LH）的分泌。而二氟甲基鳥氨酸（ODC 不可逆抑制劑）處理排卵前大鼠后，血漿中LH 含量降低，表明多胺能介導(dǎo)LH 水平參與調(diào)控繁殖[18]。據(jù)報道，在卵泡發(fā)育早期就有LHR基因開始表達，且與卵巢mRNA 水平有關(guān)[19-20]。在鵝卵巢發(fā)育早期，精胺能顯著促進LHR基因表達，而LHR基因的表達是LH 發(fā)揮調(diào)控性腺發(fā)育和繁殖功能的保證，提示精胺能介導(dǎo)LHR基因的表達參與調(diào)控鵝早期卵巢發(fā)育[15,21]。

據(jù)報道，當多胺合成受到抑制時，E2與其受體之間的結(jié)合將會受到影響[12,22]，而精胺可能與E2和ER的結(jié)合識別有關(guān)[2]。ER 有ER1 和ER2 2 種亞型，敲除ER基因后的雌鼠缺乏生殖能力，竇卵泡生長受到抑制，并出現(xiàn)多囊性卵泡。因此，ER對卵巢卵泡發(fā)育具有重要作用[23]。有研究表明，在卵巢發(fā)育過程中ER2比ER1具有優(yōu)勢[23-25]。康波等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在鵝卵巢發(fā)育早期均能檢測到ER1和ER2，并認為在介導(dǎo)雌激素調(diào)控卵巢發(fā)育及卵巢功能中ER2 更具優(yōu)勢。經(jīng)精胺灌胃后發(fā)現(xiàn)鵝卵巢ER2基因表達量顯著，而ER1基因表達無顯著差異，提示精胺可介導(dǎo)ER2基因表達參與調(diào)控雛鵝早期卵巢發(fā)育，進一步證實ER2 在早期卵巢發(fā)育中發(fā)揮主要作用。

4 結(jié) 論

外源性精胺可促進雛鵝卵巢組織ER2和LHR基因的表達，提示精胺能夠通過介導(dǎo)卵巢生殖激素受體的表達影響鵝的早期卵巢發(fā)育。