涂誠昭，雷美玲，陳慶平，葉 霖,3

1.北京理工大學(xué)材料學(xué)院，北京 100081；2.國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205；3.北京市結(jié)構(gòu)可控先進(jìn)功能材料與綠色應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

乙酰膽堿酯酶（AChE）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，能降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞。乙酰膽堿酯酶參與細(xì)胞的發(fā)育和成熟，能促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生。有機(jī)磷化合物例如農(nóng)藥和化學(xué)武器在進(jìn)入體內(nèi)后能夠迅速與體內(nèi)的膽堿酯酶結(jié)合，使其喪失水解乙酰膽堿的功能，通過膽堿積聚引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能紊亂，特別是引起呼吸功能障礙，從而影響生命活動[1-3]。研究者利用這一特異性制備了非常靈敏的AChE 生物傳感器，用于各類有機(jī)磷化合物的檢測[4-5]。此外，還有學(xué)者利用AChE 修飾金納米顆粒，將其與核酸適配體修飾的磁性納米粒子組裝，得到了用于檢測Hg2+和Pb2+的生物傳感檢測器[6]。

相對于包括高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法和酶抑制法等在內(nèi)的傳統(tǒng)檢測方法，基于AChE 的生物傳感器檢測技術(shù)因其快速、高效和低成本等優(yōu)點(diǎn)，在有機(jī)磷化合物的檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[7]。但是，和其他酶類似，AChE 也存在環(huán)境敏感、極易失活等缺點(diǎn)。因此，必須通過各種手段提高AChE 的穩(wěn)定性，才能制備出可應(yīng)用的AChE 生物傳感檢測器[8-12]。通過原位自由基聚合技術(shù)來制備蛋白納米膠囊是一種固定化酶的新思路[13-15]。2006 年YAN 等[16]最先報(bào)道了以辣根過氧化物酶（HRP）作為目標(biāo)蛋白，在蛋白表面原位聚合形成聚合物外殼，得到具有“核-殼”結(jié)構(gòu)的酶納米膠囊來提高酶穩(wěn)定性的策略。隨后，WEN 等[17-18]制備了有機(jī)磷水解酶（OPH）納米膠囊，證明了納米膠囊化可大大提高OPH 的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性。

本工作采用N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺（NAS）修飾AChE 并在其表面引入雙鍵，然后再引發(fā)丙烯酰胺和N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺的原位自由基聚合制備AChE 納米膠囊，大大提高了AChE 的穩(wěn)定性，非常適合應(yīng)用于制備生物傳感檢測器。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 納米膠囊化AChE 的制備

以下反應(yīng)和處理如無特殊說明均在0～4 ℃的冰水浴中進(jìn)行。將AChE 溶解在Tris 緩沖溶液（pH值為8.5，50 mmol/L）中，濃度為1 mg/mL，之后加入N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺（NAS）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI），磁力攪拌反應(yīng)2 h，AChE，EDCI和NAS 投料質(zhì)量比2:1:1。將反應(yīng)后的溶液放入截流分子量為500 的透析袋中透析2 d，透析液為Tris 緩沖溶液。隨后，按照表1 所示的投料比向已經(jīng)丙烯?；幚淼拿溉芤褐屑尤雴误w丙烯酰胺（AAM）和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸鹽酸鹽（APM），向溶液中緩慢通入氮?dú)獬?，然后依次加入交?lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS）、引發(fā)劑過二硫酸銨（APS）和四甲基乙二胺（TEMED），引發(fā)自由基聚合反應(yīng)，反應(yīng)2 h。將反應(yīng)溶液用Tris 緩沖溶液透析2 d，得到有機(jī)磷水解酶納米膠囊。再透析2 d 除去未反應(yīng)的原料，每隔6～8 h 換一次透析液，透析液為Tris-HCl 緩沖液（pH 值為8.5）。

表1 AChE 納米膠囊的質(zhì)量投料比Table 1 Feeding mass ratios of the AChE nanocapsules

1.2 動態(tài)光散射分析

將AChE 或nAChE 用Tris 緩沖液稀釋至0.1 mg/mL。然后，各取1 mL 裝入測試Zeta 電位專用的一次性樣品池中，放入粒度分析儀和Zeta 電位分析儀中進(jìn)行粒徑和Zeta 電位測試。具體測試條件設(shè)置如下：溫度25 ℃，選擇測試樣品為蛋白模式，采用系統(tǒng)默認(rèn)最優(yōu)化測試方式獲取數(shù)據(jù)點(diǎn)，測試3次，取平均值。

1.3 酶活測定

稱取0.04 g 5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（DTNB）溶于10 mL Tris-HCl 緩沖液中，待DTNB 完全溶解后遮光保存。取0.5 mL DTNB 溶液，定容至50 mL 后混勻遮光保存。為防止溶液變質(zhì)，要求現(xiàn)配現(xiàn)用。稱取0.216 9 g 碘代硫代乙酰膽堿（底物，75 mmol/L）溶于10 mL 去離子水中，混合均勻。

準(zhǔn)確稱取0.012 g（0.1 mmol）L-半胱氨酸，定容至100 mL 得到L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。在試管中加入不同量的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液和Tris 緩沖液，總體積為2 mL。然后每管再加入2 mL 濃度為0.1 mol/mL的DTNB 溶液，用紫外分光光度計(jì)在412 nm 處測定L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取200 μL 酶液加入3 mL Tris 緩沖液中，混合均勻后在30 ℃下保溫10 min。然后在混合液中加入600 μL 濃度為0.1 mol/mL 的DTNB 溶液與200 μL 濃度為75 mmol/L 的碘代硫代乙酰膽堿溶液，在412 nm 處每30 s 測一次吸光度變化，連續(xù)測試3 min，得到酶分解底物的動力學(xué)曲線。酶活定義為每分鐘釋放出1 μmol 半胱氨酸所需要的酶的物質(zhì)的量。酶活性計(jì)算公式如式（1）：

其中：V為酶活性，mol/(mg·min)；OD412為412 nm紫外吸光度；4(1)為反應(yīng)總體積，mL；N為酶液稀釋倍數(shù)。

1.4 穩(wěn)定性測試

將AChE 原酶和AChE 納米膠囊分別用Tris-HCl 緩沖液配制成濃度為1 mg/mL 的酶液，每個(gè)樣品分裝裝至已預(yù)熱的離心管中，置于53 ℃烘箱。分別在20，40，60，80 和100 min 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，按1.4 節(jié)的方法檢測AChE 原酶和AChE 納米膠囊的熱穩(wěn)定性。配制質(zhì)量體積比為20%的DMSO（二甲基亞砜）的酶液，混合均勻后靜置。分別在20，40，60，80 和100 min 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，按1.3 節(jié)的方法檢測AChE 原酶和AChE 納米膠囊在含有機(jī)溶劑的溶液中的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 AChE 納米膠囊的制備與表征

AChE 表面含有大量胺基，通過NAS 可以將雙鍵引入。隨后，加入AAM 和APM 2 種單體和BIS交聯(lián)劑引發(fā)其原位自由基聚合可以在AChE 表面形成聚合物外殼，即得到AChE 納米膠囊。由于聚合物外殼的保護(hù)作用，所得到的AChE 酶具有包括熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性在內(nèi)的更好的環(huán)境穩(wěn)定性，更適合在生物傳感檢測器中應(yīng)用。

圖1 原位自由基聚合制備AChE 納米膠囊Fig.1 Preparation of AChE nanocapsules by in-situ radical polymerization

在納米膠囊的制備過程中，隨著聚合的進(jìn)行，單體逐漸在酶表面聚合成分子鏈，通過交聯(lián)劑的作用將分子鏈連接成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最終在酶表面形成一個(gè)聚合物外殼，使得酶的粒徑變大。取10 μL AChE和AChE 納米膠囊酶液滴于銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干后用磷鎢酸染色，再次風(fēng)干后置于透射電鏡（TEM）下觀察微觀形貌，照片如圖2 所示。從TEM 照片來看，AChE 原酶的尺寸在30 nm 左右，納米膠囊包覆后AChEn1 的尺寸增長到70 nm 左右。在AChEn1 的圖中能觀察到外圍淺、內(nèi)核深的核殼結(jié)構(gòu)，說明在AChE 的表面形成了聚合物外殼。且每個(gè)納米膠囊中，顏色較深的內(nèi)核尺寸約為30 nm，說明每個(gè)膠囊中只含有一個(gè)AChE 分子。

圖3 為DLS 測得的AChE 和AChE 納米膠囊的粒徑尺寸和表面電勢。由圖可知，AChE 原酶的粒徑在55 nm 左右，而各組AChE 納米膠囊的粒徑均增長至100 nm 左右。相比于TEM 結(jié)果，AChE 和AChEn1 的尺寸都相應(yīng)的增大一些，原因可能是在銅網(wǎng)上制樣風(fēng)干后，聚合物外層干燥收縮嚴(yán)重，測得的尺寸比在水溶液中的尺寸小。但兩個(gè)結(jié)果都能說明納米膠囊化后AChE 的尺寸有所增大。從AChEn1 到AChEn3，兩種單體和交聯(lián)劑的投料比逐漸增加，增加單體投料量會同步增加納米膠囊外殼的分子量，即增厚外殼；而增加交聯(lián)劑投料量則會增加外殼的交聯(lián)程度。交聯(lián)程度的增加會使得外殼越來越致密并影響外殼在水溶液中的溶解性和舒展程度。較高的交聯(lián)程度使得AChEn3 的外殼在水溶液中比較致密而不舒展，導(dǎo)致DLS測得其粒徑相對于AChEn1和AChEn2更小一些。AchEn3，AchEn4和AchEn5 之間總單體投料比相同但單體組成不同。圖3（a）中AchEn3 和AchEn5 的數(shù)據(jù)非常接近，相互之間并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AchEn4 尺寸稍大則可能與其中APM 投料比最高有關(guān)。APM 分子尺寸較大且水溶性良好，因此APM 含量較多的納米膠囊具有較厚和舒展的外殼，DLS 測得的粒徑也會相對大一些。

圖2 AChE（a）和AChE 納米膠囊（b）的TEM 照片F(xiàn)ig.2 TEM images of AChE (a) and AChE nanocapsules (b)

圖3 AChE 和AChE 納米膠囊的尺寸（a）和表面電勢（b）Fig.3 Size (a) and surface potential (b) of AChE and AChE nanocapsules

在堿性的Tris 緩沖液中，溶液pH 值大于AChE 的等電點(diǎn)，抑制其表面氨基吸收質(zhì)子，促進(jìn)羧基電離，使得表面電勢為負(fù)值。而由于在納米膠囊化的過程中所加入的兩種單體AAM 和APM 帶正電，聚合完成后其外殼也應(yīng)該是帶正電的。因此，AChE 納米膠囊的表面應(yīng)該為正電勢。由此，圖3（b）中AChE 納米膠囊的正電勢也進(jìn)一步證明了聚合物外殼的形成和納米膠囊的成功制備。

2.2 AChE 納米膠囊的酶活測定

AChE 納米膠囊的酶活測定結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，與AChE 原酶[酶活225 nmol/(mg·min)]相比，各組納米膠囊化的酶活保留率達(dá)到91.6%以上。由于酶的環(huán)境敏感性，納米膠囊化過程會造成一定酶活的損失。導(dǎo)致酶活損失的環(huán)境因素可分為兩大類，一類是由溫度和溶液狀態(tài)等非反應(yīng)因素，納米膠囊化過程中的反應(yīng)溫度是0～4 ℃，AChE 始終處于溶液而非凍存狀態(tài)下，會導(dǎo)致一定的酶活損失；另一類則是納米膠囊化的反應(yīng)因素，包括加入的各種試劑以及透析、攪拌等反應(yīng)操作。為進(jìn)一步理清這兩大類環(huán)境因素對酶活的影響，設(shè)置了一個(gè)對照組AChE-c，將其與參加反應(yīng)的AChE置于相同的環(huán)境下但不向其中加入任何的反應(yīng)試劑，測定AChE-c 的酶活可以反映出非反應(yīng)因素對酶活的影響。由圖可知，AChE-c 的酶活保留率約為92%[207 nmol/(mg·min)]。這一數(shù)值與各組納米膠囊化的酶活保留率基本相當(dāng)。說明本工作采用的納米膠囊化過程十分溫和，反應(yīng)本身對酶活的影響很小，各組AChE 納米膠囊的酶活損失主要是由溫度和溶液狀態(tài)等納米膠囊化過程中的非反應(yīng)因素所導(dǎo)致的。較小的酶活損失可以保證AChE 納米膠囊在生物傳感檢測領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

圖4 AChE 納米膠囊的酶活保留率Fig.4 Retention of enzyme activity of AChE nanocapsules

2.3 AChE 納米膠囊的穩(wěn)定性

生物傳感檢測器在實(shí)際應(yīng)用中會遇到許多包括高溫、有機(jī)溶劑在內(nèi)的嚴(yán)苛環(huán)境。為了保證其能夠在嚴(yán)苛環(huán)境下正常使用，要求酶在嚴(yán)苛環(huán)境中具有相當(dāng)高的穩(wěn)定性。分別考察了AChE 納米膠囊的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5 和6 所示。

圖5 不同單體投料量（a）和不同單體投料比（b）的AChE 納米膠囊在53 ℃環(huán)境中酶活的變化Fig.5 Changes of enzyme activity of AChE nanocapsules with different monomer feeding amount (a) and feed ratios (b) at 53 ℃

圖5（a）給出了不同單體投料量的AChE 納米膠囊的熱穩(wěn)定性。從AChEn1 到AChEn3，兩種單體和交聯(lián)劑與AChE 的投料比逐漸增加，這也就意味著這3 種納米膠囊外殼的厚度和致密程度都在不斷增加。從圖中可以看出，未包覆的AChE 在53 ℃的環(huán)境中，酶活隨時(shí)間的變化下降迅速，60 min內(nèi)下降至原始酶活的82%，100 min 后已下降至66%。而經(jīng)過包覆后的酶的活性下降較為平緩，在40 min內(nèi)酶活下降很小，酶活保留率仍為95%左右。在100 min 后，AChEn1，AChEn2 和AChEn3 的酶活分別為為161，176 和189 nmol/(mg·min)，酶活保留率分別為75%，83%和89%。

在加熱條件下，AChE 納米膠囊的酶活遠(yuǎn)高于AChE 原酶，說明納米膠囊的聚合物外殼起到了保護(hù)作用，使得加熱時(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)不被破壞。說明相對于AChE 原酶，AChE 納米膠囊具有更好的熱穩(wěn)定性。此外，圖中還可以看出，從AChEn1 到AChEn3，酶活保留率隨著聚合物外殼的的厚度和致密程度不斷提高，表明更厚和更致密的聚合物外殼具有更好的熱穩(wěn)定性。圖5（b）給出了不同組成的AChE 納米膠囊的在加熱條件下的酶活保留率，從圖中可以看出，3 種不同組成的AChE 納米膠囊AChEn3，AChEn4 和AChEn5 在不同時(shí)間點(diǎn)的酶活保留率都遠(yuǎn)高于AChE 原酶，但相互之間數(shù)值接近，幾乎無差異。這也從另一個(gè)角度說明AChE 納米膠囊熱穩(wěn)定性的提高主要來自其聚合物外殼的隔熱作用。因?yàn)楫?dāng)總投料比一致的情況下，組成的變化對聚合物外殼致密程度影響不大。

圖6（a）為不同單體投料比的AChE 納米膠囊在DMSO 中的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性考察結(jié)果。由圖可知，在20%DMSO溶液中靜置100 min后AChE原酶的酶活保留率可降至初始值[139 nmol/(mg·min)]的60%，而AChE 納米膠囊的酶活保留率明顯高于AChE 原酶。AChEn1，AChEn2 和AChEn3 的酶活分別為143，157 和177 nmol/(mg·min)，酶活保留率為初始值的67%，74%和83%。說明AChE 納米膠囊相比AChE 原酶具有更高的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性。而與熱穩(wěn)定性的規(guī)律相似，隨著投料比的增加，從AChEn1到AChEn3，酶活保留率不斷提高，說明更致密的聚合物外殼具有更好的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性。圖6（b）為不同組成的AChE 納米膠囊AChEn3，AChEn4 和AChEn5 在20%DMSO 中的酶活保留率，可看到3 種不同組成的AChE 納米膠囊在不同時(shí)間點(diǎn)的酶活保留率都遠(yuǎn)高于AChE 原酶，但相互之間數(shù)值幾乎無差異，說明了AChE 納米膠囊有機(jī)溶劑穩(wěn)定性的提高主要來自其聚合物外殼的物理隔絕作用，組成的變化對有機(jī)溶劑穩(wěn)定性的影響不大。

圖6 不同殼層厚度（a）和不同單體投料比（b）的AChE 納米膠囊在20%DMSO 中酶活的變化Fig.6 Changes of enzyme activity of AChE nanocapsules with different shell thickness (a)and monomer feed ratios (b) in 20%DMSO

3 結(jié) 論

本工作通過兩步法，即先對AChE 進(jìn)行丙烯酰化修飾，然后再采用原位自由基聚合的方式，制備了具有聚合物外殼的AChE 納米膠囊。動態(tài)激光光散射結(jié)果表明AChE 尺寸明顯增大，其表面電勢也由負(fù)轉(zhuǎn)正，證明了AChE 納米膠囊的成功制備。酶活測試結(jié)果表明，AChE 納米膠囊的酶活保留率可以達(dá)到AChE 原酶的90%以上。而穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)則顯示，AChE 納米膠囊具有遠(yuǎn)高于AChE 原酶的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明，AChE 納米膠囊在生物傳感檢測領(lǐng)域具有應(yīng)用的良好前景。