巫霞，任妍，巫慧敏

（電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院成都市婦女兒童中心醫(yī)院保健部，四川成都611731）

急性肺炎是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，具有發(fā)病迅速、發(fā)展速度快、不易治療等特點，嚴重者可誘發(fā)心血管系統(tǒng)疾病，甚至危及生命[1]。急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）是由多種原因引發(fā)的肺組織損傷，主要以肺組織炎癥、氧化損傷、細胞凋亡等為病理特點。ALI是由全身炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的綜合征，死亡率高達40%以上[2-3]。IL-27是近年發(fā)現(xiàn)的IL-12家族新成員，目前已經(jīng)證明其在機體內(nèi)具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，既能促進某些疾病的發(fā)生、發(fā)展，又能抑制某些疾病的進展[4]。STAT3是在炎癥和癌癥中被激活的STAT蛋白家族的關(guān)鍵成員，其通過磷酸化從細胞質(zhì)穿梭到核而被激活[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-27 可抑制博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化的形成，提高小鼠的生存率[6]。然而，目前有關(guān)IL-27對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎的影響研究甚少，因此，本研究探討IL-27調(diào)控STAT3信號通路在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性小鼠共32只，6～8周，體質(zhì)量18～22g，購自中國科學(xué)院昆明動物研究所，動物許可證號：SYXK（滇）2017-0009。

1.1.2 實驗試劑：LPS（美國Sigma公司），IL-27重組蛋白注射劑、IL-27 蛋白重組抗體注射劑（美國Ebioscience公司），TRIzolReagent（美國Invitrogen公司），STAT3、SOCS3、GAPDH普通PCR上下游引物（上海生工公司），SYBRGreenPCRMasterMix（大連TaKaRa公司），RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit（美國ThermoScientific公司），RIPA裂解液（上海申能博彩生物科技有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司），STAT3兔抗鼠單抗、p-STAT3兔抗鼠單抗、SOCS3兔抗鼠單抗、TNF-α兔多克隆抗體、IL-1β兔多克隆抗體（美國Abcam公司），HRP標記山羊抗兔IgG（美國SantaCruzs公司），小鼠TNF-α、IL-1β、IL-10 和TGF-β1ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器：實時熒光定量PCR儀、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），Z216MK型冷凍離心機（德國HERMLE公司），搖床（TS-8）（上海精密儀器制造公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國GE公司），脫水機、包埋機（武漢俊杰電子有限公司），石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司），正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型和分組：通過腹腔注射大腸桿菌LPS建立急性肺炎小鼠模型。32只小鼠隨機分為4組，每組8只，分別為正常對照組、LPS組、LPS+IL-27組、LPS+IL-27抗體組。參考文獻[7-8]，LPS組：腹腔注射LPS（5mg/kg）；正常對照組：腹腔注射與LPS等量的0.9%氯化鈉溶液；LPS+IL-27組：在建模后腹腔注射IL-27（200mg/只）；LPS+IL-27抗體組：在建模后腹腔注射IL-27抗體（200mg/只）。連續(xù)處理7d后麻醉處死觀察。

1.2.2 HE染色法觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)：將肺組織用0.9%氯化鈉溶液漂洗、濾紙吸干，放入4%多聚甲醛中固定48h，然后進行脫水、石蠟包埋、切片。將厚度為4μm的病理切片放置于65℃烘箱2h后，依次放入二甲苯10min，無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇各2min。蘇木素、伊紅染色。中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.2.3 Westernblot 法檢測各組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、SOCS3的蛋白表達水平：取肺組織加入RIPA裂解液于冰上提取組織中總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白進行定量。將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，沸水浴加熱變性，取等量變性蛋白樣品加入上樣孔，SDS-PAGE凝膠電泳。待蛋白分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，在質(zhì)量濃度為5%脫脂奶粉中封閉1h，TBST洗膜后加入一抗（1:2000稀釋），4℃過夜雜交，TBST洗膜后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:3000稀釋），室溫雜交1h，TBST洗膜后以ECL化學(xué)發(fā)光，于暗室成像拍照，以GAPDH為內(nèi)標蛋白，使用ImageJ分析軟件計算各組STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白相對表達水平。

1.2.4 RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織和血清中STAT3、SOCS3mRNA表達水平：TRIzol法提取小鼠肺組織及血清中總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以β-actin為內(nèi)參，分別檢測小鼠STAT3、SOCS3的mRNA表達水平。引物由深圳華大基因股份有限公司設(shè)計合成，引物序列：STAT3上游5’-CCAAGCGAGGACTGAGCATC-3’，下游5’-CCAGACCCAGAAGGAGAAGC-3’；SOCS3上游5’-CCAAGAACCTACGCATCAA-3’，下游5’-GCAGTCCAGGTGACCGTTG-3’；β-actin上游5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。擴增完畢后進行熔解曲線分析，每個樣本重復(fù)檢測3次。各組STAT3、SOCS3基因的相對表達量按公式（2-△△Ct法）計算。

1.2.5 ELISA法分別檢測肺組織及血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1的表達水平：將肺組織置于玻璃勻漿器中，按體質(zhì)量體積比1:9加入0.9%氯化鈉溶液在冰浴中充分研磨，制成10%肺勻漿，然后10000r/min離心10min取上清液；采集小鼠外周血，2500r/min離心15min取上清液；采用ELISA法檢測各組小鼠肺勻漿及血清中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和抗炎因子IL-10、TGF-β1的表達水平。

1.2.6 Westernblot法和免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中TNF-α、IL-1β表達水平：石蠟包埋，做厚度為5μm的切片。經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇逐步水化后進行熱抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶。滴加5%BSA封閉液，室溫30min，用于去除內(nèi)源性酶。滴加一抗，37℃孵育2h，棄去一抗后滴加二抗孵育30min。滴加DAB顯色劑，5min，蒸餾水洗滌。脫水、透明、封片，切片至于顯微鏡下觀察陽性細胞的表達。結(jié)果判定：TNF-α陽性染色為棕黃色或棕色；IL-1β陽性染色為深棕黃色。Westernblot法參照1.2.3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料以表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較 光鏡下觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺間質(zhì)內(nèi)無炎性細胞浸潤；LPS組肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡壁彌漫性增厚，有明顯的炎性細胞浸潤；LPS+IL-27組病理改變較LPS組明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，而LPS+IL-27抗體組與LPS組比較肺組織病理改變沒有明顯改變，表明IL-27可改善LPS誘導(dǎo)的急性小鼠肺損傷。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)（HE染色）

2.2 各組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白表達水平 與正常對照組相比，LPS組和LPS+IL-27抗體組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；LPS+IL-27組STAT3、p-STAT3蛋白表達水平較LPS組和LPS+IL-27抗體組顯著降低（P＜0.05）；LPS組和LPS+IL-27抗體組SOCS3蛋白表達水平較正常對照組升高（P＜0.05），而LPS+IL-27組SOCS3蛋白表達水平顯著高于LPS組和LPS+IL-27抗體組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、SOCS3的蛋白表達水平

2.3 各組小鼠肺組織及血清中STAT3、SOCS3mRNA表達水平 與正常對照組相比，LPS組和LPS+IL-27抗體組小鼠肺組織及血清STAT3mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；LPS+IL-27組STAT3mRNA表達水平較LPS組和LPS+IL-27 抗體組顯著降低（P ＜0.05）；LPS組和LPS+IL-27抗體組SOCS3mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而LPS+IL-27組SOCS3mRNA表達水平顯著高于LPS+IL-27抗體組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織與血清STAT3、SOCS3mRNA表達水平

2.4 各組小鼠肺組織及血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1的表達水平 與正常對照組相比，LPS組、LPS+IL-27組和LPS+IL-27 抗體組小鼠肺組織及血清TNF-α、IL-1β表達水平均顯著升高（P ＜0.05）；LPS+IL-27組TNF-α、IL-1β表達水平較LPS組和LPS+IL-27抗體組顯著降低（P＜0.05）；LPS組和LPS+IL-27抗體組IL-10表達水平均顯著高于正常對照組（P＜0.05），TGF-β1表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而LPS+IL-27組IL-10、TGF-β1的表達水平均顯著高于LPS+IL-27抗體組（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β蛋白表達水平 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LPS組和LPS+IL-27抗體組TNF-α陽性表達主要表達在細胞漿中，IL-1β陽性表達主要表達于細胞膜與細胞漿中，Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β在肺組織中均呈高表達（P＜0.05）；LPS+IL-27組TNF-α、IL-1β的表達水平較LPS組和LPS+IL-27抗體組顯著降低（P＜0.05）。見圖5-6。

3 討論

圖4 各組小鼠肺組織與血清TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1表達水平

圖6 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β蛋白表達水平

ALI是由多種因素引起的肺泡毛細血管彌漫性與正常對照組比：aP ＜0.05；與LPS組和LPS+IL-27抗體組比：bP ＜0.05損傷，導(dǎo)致肺水腫和肺不張，臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫和難治性低氧血癥，也是全身失控性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的多器官功能障礙綜合征的肺部表現(xiàn)[9]，常常由膿毒癥、敗血癥等多種病因引起，是炎癥自我放大及氧化損傷共同作用的結(jié)果[10]。LPS是引起ALI、膿毒癥等重要致病因子，其促進大量炎癥細胞因子產(chǎn)生，引起肺內(nèi)中性粒細胞的聚集和激活，是LPS致ALI的主要機制[11]。本研究通過腹腔注射LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)模擬急性肺炎動物模型，是目前公認的研究急性肺炎的經(jīng)典方法之一[1]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整、肺泡腔清晰，肺間質(zhì)內(nèi)無炎性細胞浸潤；LPS組肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡壁彌漫性增厚，有明顯的炎性細胞浸潤。本研究還發(fā)現(xiàn)，LPS組小鼠肺組織及血清TNF-α、IL-1β、IL-10表達水平較正常對照組均顯著升高，表明LPS可誘導(dǎo)急性肺炎小鼠組織及機體整體炎癥水平升高。因此，抗炎治療對LPS誘導(dǎo)的肺損傷具有保護作用[12]。

有研究報道，IL-27 可以明顯減輕免疫炎癥損傷和感染炎癥損傷，從而減輕因各種損傷因子導(dǎo)致的肺部炎性反應(yīng)[13]。GAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎患者外周血中IL-27 表達的降低有助于Th2 炎癥的上調(diào)，而且體外實驗表明IL-27抑制PBMCs中的Th2炎癥，IL-27可作為治療過敏性鼻炎的潛在靶點。另有研究發(fā)現(xiàn)，IL-27 可能通過抑制STAT1 信號通路，下調(diào)GATA3的表達并上調(diào)T-bet的表達，從而促進Th1細胞分化，抑制Th2細胞分化，抑制機體的炎癥反應(yīng)，參與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展[15]。有研究證實IL-27可通過阻斷TGF-β和IL-1誘導(dǎo)的Th17細胞分化，減少IL-17的分泌，抑制炎癥反應(yīng)[16]。本研究在急性肺炎小鼠模型基礎(chǔ)上給予IL-27及IL-27抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS+IL-27組病理改變較LPS組明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，而LPS+IL-27抗體組較LPS組肺組織病理改變沒有明顯改變，表明IL-27 可改善LPS誘導(dǎo)的急性小鼠肺組織損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，LPS+IL-27組TNF-α、IL-1β表達水平較LPS組和LPS+IL-27抗體組顯著降低；而LPS+IL-27組IL-10、TGF-β1的表達水平均顯著高于LPS+IL-27抗體組。提示IL-27 一方面可以抑制炎性細胞因子的分泌，另一方面又可以促進抗炎細胞因子的大量分泌，從正向和反向降低機體及組織中的炎癥反應(yīng)。

STAT3是一種原癌基因，存在于多種惡性腫瘤中，能夠誘導(dǎo)多種炎癥相關(guān)基因的產(chǎn)生，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子，可被多種因素激活，進而在胞內(nèi)編碼一系列炎癥相關(guān)蛋白，并促進這些蛋白的釋放，擴大炎癥反應(yīng)[17-18]。研究報道，STAT3可能與哮喘所致支氣管上皮細胞損傷有關(guān)，沉默STAT3抑制JAK/STAT3信號通路的激活，可抑制上皮細胞分泌炎性因子，保護氣道損傷[19]。SOCS3屬于細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白家族，是重要的負反饋調(diào)節(jié)蛋白，可通過E3泛素化途徑快速降解JAK2蛋白，也可通過抑制與磷酸化JAK的結(jié)合和/或促進JAK在細胞質(zhì)中的泛素化來減弱STAT3活性[20-21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS組和LPS+IL-27抗體組小鼠肺組織p-STAT3及STAT3蛋白表達水平較正常對照組顯著升高，SOCS3 表達水平較正常對照組雖有升高；LPS+IL-27組p-STAT3及STAT3蛋白表達水平較LPS組和LPS+IL-27抗體組顯著降低，SOCS3表達水平顯著升高。血清檢測結(jié)果與肺組織檢測結(jié)果一致，提示LPS可能誘導(dǎo)急性肺炎小鼠STAT3磷酸化，激活STAT3信號通路；而IL-27可促進SOCS3基因的表達從而抑制STAT3的磷酸化，對急性肺炎小鼠肺組織起到保護作用。

綜上所述，IL-27可改善LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎，其機制可能與IL-27抑制STAT3信號通路相關(guān)蛋白磷酸化有關(guān)。