陳潔，次曉蕊，張娟娟，2，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究所，浙江溫州325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院科研中心，浙江溫州325027）

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber’shereditaryopticneuropathy，LHON）是一種線粒體母系遺傳性疾病。該病主要累及視網(wǎng)膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束纖維，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞退行性病變[1]，主要表現(xiàn)為視力同時或先后進行性的減退，單側(cè)或雙側(cè)眼均可累及，可同時伴有中心視野缺失及色覺障礙，部分患者的視力經(jīng)治療后可好轉(zhuǎn)。除了三大原發(fā)性突變外，還發(fā)現(xiàn)了m.3376G＞A、m.3394G＞A、m.4640C＞A、m.12338T＞C、m.14325T＞C等繼發(fā)突變與LHON相關(guān)[2-5]。在LHON家系中，可以發(fā)現(xiàn)各年齡均可發(fā)病，以青壯年男性居多。研究表明，線粒體單體型與許多疾病的發(fā)生密不可分[6-8]。為分析線粒體單體型對LHON外顯率的影響，本研究對搜集的血液標(biāo)本進行m.3460G＞A的篩查、家系調(diào)查、線粒體單體型及保守性分析。

1 對象和方法

1.1 對象 本課題組自2004年起在全國范圍內(nèi)收集了1218例LHON血樣，同時采集376例正常人群的靜脈血做對照，經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受檢者簽署知情同意書，并采集外周靜脈血4mL（EDTA-K2抗凝）或制成濾紙片。

1.2 方法

1.2.1 眼科臨床檢查：對LHON患者及部分家系成員進行眼科臨床檢查，包括標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)視力表檢測視力、色覺檢查、視野計檢查視野、電生理儀檢測視覺誘發(fā)電位等。視力損害程度參照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)：正常＞0.3；0.1≤輕度≤0.3；0.05≤中度＜0.1；0.02≤重度≤0.05；極重度＜0.02。

1.2.2 線粒體DNA提取、PCR擴增及測序：將收集到的外周靜脈血或者血濾紙片用經(jīng)典的酚-氯仿法提取線粒體DNA、測濃度，接著對m.3460G＞A突變所在的片段通過正向引物5’-TACTTCACAAAGCGCCTTCC-3’和反向引物5’-ATGAAGAATAGGGCGAAGGG-3’進行PCR擴增、1.5%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，擴增條件以及檢測方法見參考文獻[9]。然后再用其余23對有部分重疊的正反向引物[10]對DNA進行測序，通過CodonCode序列分析軟件將測得的線粒體全序列與修正的mtDNA劍橋參考序列（Cambridgereferencesequence，rCRS，NC_012920.1）[11]進行對比分析，統(tǒng)計所有的變異位點。

1.2.3 線粒體單體型分析：人類線粒體基因組中存在4000多個單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位點，且相鄰SNPs的位點傾向于以一個整體遺傳給后代。而位于mtDNA上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP位點被稱作線粒體單體型。通過線粒體全基因組的變異位點進行線粒體單體型分析[12]，確定正常對照組及攜帶m.3460G＞A突變者的線粒體單體型。

1.2.4 保守性分析：用17種哺乳動物，即：小鼠、人、牛、白手長臂猿、節(jié)尾狐猴、卷尾猴、獼猴、馬來跗猴、地中海獼猴、蜂猴、大猩猩、倭黑猩猩、猩猩、蘇門答臘猩猩、黑猩猩、阿拉伯狒狒、爪蟾的線粒體DNA與本研究相對應(yīng)的變異位點進行對比，計算該位點的保守系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn) 對來自全國不同地區(qū)的1218例LHON血樣的mtDNA篩查中，發(fā)現(xiàn)有17例攜帶有m.3460G＞A突變。其中有2例紅綠色盲，1例紅綠色弱，7例光幻覺、瞳孔對光反射減弱、耳鳴、眼痛、運動障礙，個別患者視盤蒼白，視野中心暗點，盤緣小血管擴張、出血。有3例患者的視力同時且突然下降，1例患者的視力先后、漸進下降。還有1例患者在視力下降服用藥物后，也沒有明顯的好轉(zhuǎn)。多數(shù)患者視力下降無明顯痛感。

2.2 先證者家系資料 17 例攜帶者均為先證者，男12例，女5例。視力損傷程度從輕度至極重度不等。發(fā)病年齡5～38歲，平均20.5歲。在這17個家系中，每個家系之間的男女患病比例不一，家系外顯率高低不等，且17 個家系的平均外顯率為16.3%。其中WZ84-III-1攜帶繼發(fā)突變m.15927G＞A，WZ522-II-2攜帶有m.14831G＞A和m.15927G＞A兩個繼發(fā)突變，WZ736-III-8攜帶有繼發(fā)突變m.13637A＞G及m.14502T＞C，WZ1109-III-4攜帶一個繼發(fā)突變m.12811T＞C。其家系圖及相關(guān)信息見圖1和表1。

2.3 線粒體全基因組變異位點統(tǒng)計及保守性分析 將所有的測序結(jié)果與rCRS進行比對分析后發(fā)現(xiàn)，17例先證者攜帶的m.3460G＞A突變均為同質(zhì)性突變。同時篩查出243個已報道的變異位點，包括非編碼區(qū)突變有77個，RNA編碼區(qū)有25個，氨基酸編碼區(qū)有141個。還有10個之前未報導(dǎo)的變異位點，其中RNA編碼區(qū)有2個，氨基酸編碼區(qū)8個。在這些變異中，有6個變異位點堿基缺失，9個變異位點堿基插入。

保守系數(shù)是衡量基因功能重要程度的標(biāo)準(zhǔn)之一，攜帶有重要功能的基因片段通過不斷地進化被保留下來。一般來說，保守系數(shù)高說明了該序列發(fā)揮的功能越重要，突變后對機體產(chǎn)生的影響就越大。反之，保守系數(shù)低說明該位點突變后對機體的影響就越小。通過計算17個先證者突變位點的物種間保守系數(shù)，發(fā)現(xiàn)保守系數(shù)為100%的位點有34個，80%～100%的位點有18個，60%～80%的有25個，低于60%的突變位點有48個。其中原發(fā)突變m.3460G＞A的保守系數(shù)為94.12%。

2.4 線粒體單體型統(tǒng)計 17例先證者的單體亞型分別是A、B5b、B5b2、C4a1、D4、D5b1、F1、F1a1、H2、M7c1、M7b1、M7b2、M8a2、M10a、M12，其中亞型D5b1有3例，其余各1例。在對照組中，這些單體亞型依次有35例、10例、22例、3例、6例、19例、16例、13例、0例、7例、0例、10例、13例、16例、0例。有11例屬于單體型M，占64.71%；6例屬于單體型N，占35.29%。單體亞型的分布見表2。

圖1 17例先證者家系圖

3 討論

m.3460G＞A是LHON的三大原發(fā)突變之一，位于線粒體復(fù)合體I的ND1基因上的第52個位點，該位點基因突變導(dǎo)致胸腺嘧啶（G）變?yōu)橄汆堰剩ˋ），編碼的蘇氨酸取代丙氨酸。流行病學(xué)研究表明，LHON的外顯率是核基因修飾[13]、特定的生活環(huán)境、表觀遺傳學(xué)、線粒體DNA本身的特點相互作用的結(jié)果。生活習(xí)慣如吸煙對LHON發(fā)病的影響不依賴于性別和飲酒習(xí)慣而獨立發(fā)生[14]，只有當(dāng)過量飲酒時，LHON的發(fā)病才受酗酒的影響[15]。在本研究17例先證者中，除3例有少量的吸煙及飲酒史外，其余均無，說明吸煙、飲酒并不是導(dǎo)致這些患者發(fā)病的主要原因。

此外，mtDNA的單倍體型也是影響LHON發(fā)生的重要因素，因為不同的單體型本質(zhì)上是不同的堿基發(fā)生突變。mtDNA在轉(zhuǎn)錄、翻譯的過程中，缺乏有效的修復(fù)機制，導(dǎo)致堿基突變率較高；不同基因片段的堿基發(fā)揮的功能不同，而且不同的單倍體的堿基突變的位點也不同，對mtDNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯及翻譯后修飾、呼吸鏈復(fù)合體的組裝及其穩(wěn)定性、氧化磷酸化的修飾的影響不同，進而不同程度地影響了線粒體的能量供應(yīng)，致使不同的線粒體DNA單倍體對某些特定疾病有不同的易感性及外顯率[16]。

單體型A是單體型N的亞型，是WZ881先證者的單體型。患者為女性，視力重度損傷。與其他家系不同的是，該家系中的女性發(fā)病人數(shù)（5 例）明顯多于男性（1例），這說明單體型A傾向于增加攜帶m.3460G＞A突變家系中女性患者的外顯率。

單體型B的亞型有2例，分別是B5b2、B5b，這兩位先證者均在青年時期就表現(xiàn)為輕度視力損傷，家系外顯率分別是12.50%、7.14%，均低于家系平均外顯率16.28%。其中單體型B5b的先證者還有紅綠色盲，該單體型特征性突變m.15927G＞A在對照組中有14 人攜帶此突變，物種間的保守系數(shù)為68.75%。對16個中國漢族家庭的295人攜帶m.3460G＞A的LHON研究發(fā)現(xiàn)，攜帶m.15927G＞A的單體型B可以明顯增加家族LHON的外顯率[17]。本課題組發(fā)現(xiàn)攜帶m.15927G＞A特異突變可導(dǎo)致細胞的ROS增多、ATP產(chǎn)量減少、影響復(fù)合體I和復(fù)合體III的活性、降低tRNAThr的穩(wěn)定性[18]。此外，單體型B5b2先證者除攜帶繼發(fā)突變m.15927G＞A外，還攜帶有另一個繼發(fā)突變m.14831G＞A，但是視力損害并沒有想象的更加嚴(yán)重，且該突變位點在正常對照組中沒有，說明同時攜帶原發(fā)突變和繼發(fā)突變并不一定會加重視力損傷。

表1 17例攜帶m.3460G＞A突變的先證者視力損傷程度及家系外顯率

表2 17例先證者的單體亞型分布

單體型F1a1及F1在正常對照組中共有29例，但在17例先證者中，這兩種單體型各有1例，視力損傷程度分別是重度、輕度，F(xiàn)1a1的先證者還表現(xiàn)為紅綠色弱。該單體型的突變位點m.9548G＞A位于線粒體COIII上，保守性100%，有2.92%正常人群攜帶有此突變位點，其余突變位點的保守性較低。有研究表明，該單體型可能會降低攜帶m.14484T＞C突變?nèi)巳篖HON發(fā)病的風(fēng)險[19]。此外，單體型F在攜帶m.11778A＞G突變的泰國人群中比例很低，可能降低視力損傷[20]。國內(nèi)的研究也表明攜帶m.11778A＞G或m.14484T＞C突變的LHON發(fā)病率較低[21]。至于單體型F在攜帶m.3460G＞A突變?nèi)巳褐惺欠褚舶l(fā)揮同樣的作用，有待更深入的研究。

單體型H2也是單體型N的一個亞型，在正常對照組中沒有，在病例組只有1例，表現(xiàn)為重度視力損傷，紅綠色盲，家族外顯率為12.50%。對歐洲159個獨立的LHON家系中的3613名成員研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有m.3460G＞A突變位點的占18%，其中線粒體單體型H可以降低LHON外顯率[22]。紅綠色盲與視力損傷之間是否存在因果關(guān)系仍未知。

在17例攜帶m.3460G＞A原發(fā)突變的患者中，C4a1、M7b1、M7b2、M7c1、M8a2、M10a、M12都是單體型M的亞型，這些患者均表現(xiàn)為重度至極重度的視力損傷，家系外顯率為7.14%～42.86%。單體型M7b1還攜帶有一個繼發(fā)突變m.12811T＞C。在對攜帶有m.11778G＞A突變的LHON患者的單體型研究發(fā)現(xiàn)，M7b1的家系患病成員也為女性，中度視力損傷，而相同的單體型在攜帶m.3460G＞A突變時表現(xiàn)為重度視力損傷[23]。單體型M10a的先證者也攜帶有一個繼發(fā)突變m.14502T＞C，保守系數(shù)為78%。本課題組先前的研究表明，攜帶有m.14502T＞C及m.14484T＞C突變的家系外顯率明顯高于僅攜帶m.14484T＞C突變的家系外顯率的LHON外顯率[24]，但對攜帶m.3460G＞A突變的家系外顯率有何影響還未知。

D4、D5b1也是單體型M的亞型。其中D4在正常對照組中有6例，在突變組有1例，該患者5歲發(fā)病，家系外顯率11.11%，視力損傷為重度，沒有發(fā)現(xiàn)其他母系成員出現(xiàn)視力損傷。而D5b1在正常對照組中有19例，在突變組中有3例，視力損傷分別表現(xiàn)為輕度、中度及重度。由此可以看出攜帶m.3460G＞A原發(fā)突變對該單體型的視力損傷輕重不一。

綜上所述，通過分析17個先證者單體型，發(fā)現(xiàn)不同的單體型對視力損傷的程度不同。但是總體來說，單體型N的視力損傷較單體型M的輕，但是出現(xiàn)紅綠色盲、色弱的可能性較單體型M高。m.3460G＞A這個原發(fā)突變在不同的線粒體單體型中發(fā)揮著怎么的作用？為何會導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的視力損傷？相同的單體型，為什么有人視力受損？而有人視力表現(xiàn)正常？應(yīng)該采取什么措施預(yù)防和治療LHON進而提高患者的生活質(zhì)量？這些問題有待進一步研究。