程水兵，郭洋洋，朱恒悅，肖言一，鄭士樟，戚如意，周俊雷，楊梅，白永恒

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江溫州325015，1．創(chuàng)傷外科；2．浙江省胰腺肝臟危重性疾病診治新技術(shù)研究重點實驗室；3.重癥醫(yī)學(xué)科）

腎間質(zhì)纖維化是腎臟損傷逐步進展的結(jié)果，同時也是造成腎臟功能減退不可逆的原因之一。典型的腎纖維化發(fā)生機制為各種原因（缺血缺氧、氧化應(yīng)激等）引起轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）等促纖維化因子的過度產(chǎn)生和釋放，誘導(dǎo)α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）陽性的肌成纖維細(xì)胞活化和積聚，最終導(dǎo)致大量的細(xì)胞外基質(zhì)（如I型和III型膠原）成分在腎間質(zhì)沉積所致[1]。然而，目前尚不十分清楚腎損傷過程中促纖維化因子如何被誘導(dǎo)產(chǎn)生，進而活化肌成纖維細(xì)胞。前期研究顯示，氧化應(yīng)激重要的調(diào)節(jié)分子—核因子E2 相關(guān)因子（nuclearfactorerythroid-2relatedfactor2，Nrf2）可能參與腎纖維化進程[2-3]。Nrf2 可以通過抗氧化和抑制炎癥反應(yīng)，從而實現(xiàn)減輕腎損傷，保護腎小管間質(zhì)纖維化作用[4]。本研究通過體內(nèi)應(yīng)用Nrf2 基因敲除小鼠構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻（unilateralureteralobstruction，UUO）動物模型，觀察敲除Nrf2對腎肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和間質(zhì)纖維化的作用，及敲除Nrf2對TGF-β1分泌水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 Nrf2（又稱Nfe212）基因敲除小鼠（B6.129X1-Nfe212tm1ywk/J）購自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院，動物許可證號：SCXK（蘇）2015-0001。野生型B6小鼠（C57BL/6）購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（浙）2019-0009。PAS染色試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)公司；Masson試劑盒購自北京Solarbio公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋公司；兔抗α-SMA抗體（美國CST公司）；兔抗TGF-β1 和III型膠原抗體（美國Bioworld公司）；TRIzol試劑，購自美國Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自日本Toyobo公司；AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）；MyCycler梯度PCR儀（美國Bio-Rod公司）；7500Fast定量PCR儀（美國AppliedBiosystens公司）；VarioskanFlash全波長多功能掃描儀（美國ThermoScientific公司）；DM4000BLED熒光正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備：將實驗小鼠分成Nrf2野生型假手術(shù)組、Nrf2野生型UUO組、Nrf2敲除型假手術(shù)組、Nrf2敲除型UUO組4個小組，每組6只。UUO模型組進行左側(cè)輸尿管結(jié)扎，假手術(shù)組開腹后游離左側(cè)輸尿管不予結(jié)扎，于術(shù)后第7天取梗阻側(cè)腎組織用于指標(biāo)檢測。UUO模型標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵在于無菌操作和結(jié)扎于輸尿管上1/3處。

1.2.2 生化分析儀檢測血肌酐和尿素氮水平：取每只小鼠的外周血，1500r/min離心10min分離出血清，全自動生化分析儀檢測血肌酐和尿素氮水平。

1.2.3 PAS染色觀察腎組織病理變化：梗阻側(cè)腎取出后，進行縱軸和橫軸測量。橫截面切割切開后加入4%多聚甲醛固定，按常規(guī)方法進行組織脫水、透明、浸蠟和包埋。切成約4μm厚的切片，經(jīng)脫蠟、梯度乙醇脫水，根據(jù)試劑盒說明書進行PAS染色，中性樹膠封片。通過顯微鏡觀察腎組織切片，對腎小管間質(zhì)損傷程度進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[5]。

1.2.4 Masson染色觀察腎組織纖維化：石蠟切片脫蠟后，按試劑盒說明書操作。蘇木素-三氯化鐵染核10min；鹽酸乙醇分化、水洗；氨水反藍(lán)，水洗；麗春紅酸性染液染色10min，醋酸洗1min；1%磷鉬酸作用2min，直接用苯胺藍(lán)染色2min；直接95%乙醇分化30s；脫水、透明、封片、鏡檢。Masson染色后肌纖維為紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[5]。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測TGF-β1、α-SMA和III型膠原的表達(dá)：用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化酶法。標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚4μm。枸櫞酸鹽微波輻射進行抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺顯色后經(jīng)蘇木精復(fù)染。以一抗稀釋液代替一抗作為陰性對照，細(xì)胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。光鏡下每張切片隨機選取10個高倍視野（×200），應(yīng)用Image-ProPlus6.0軟件，計算每個視野下陽性表達(dá)區(qū)域的平均光密度值（累積光密度/分析面積）。

1.2.6 RT-qPCR檢測TGF-β1mRNA的表達(dá)：采用TRIzol試劑提取小鼠腎組織中的RNA，于260/280nm測定吸光度值以確定樣本純度和濃度。根據(jù)試劑說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計小鼠TGF-β1mRNA的特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參，引物由上海生工公司合成，見表1。PCR擴增體系：5μL2×SYBRGreen熒光定量試劑、2μL引物（上、下游各1μL，終濃度200nmol/L）、2μL反應(yīng)緩沖液、1μLcDNA。PCR程序為：95℃3min預(yù)變性，1 個循環(huán)；95℃5s，60℃35s，40 個循環(huán)。采用相對定量法計算獲得結(jié)果，溶解曲線分析結(jié)果的可靠性。相對表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=

表1 TGF-β1和內(nèi)參β-actin的mRNA引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用GraphPadPrism7.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用表示，多組間的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠腎功能比較 與Nrf2 野生型假手術(shù)組比，Nrf2野生型UUO組外周血清中血肌酐和尿素氮水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。Nrf2敲除型UUO組血肌酐和尿素氮水平與Nrf2野生型UUO組比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 4組小鼠腎組織損傷程度比較 與Nrf2野生型假手術(shù)組比，Nrf2野生型UUO組腎小管擴張和間質(zhì)面積擴大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Nrf2敲除型假手術(shù)組比，Nrf2敲除型UUO組腎小管擴張和間質(zhì)面積擴大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組腎小管擴張和間質(zhì)面積擴大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖1 4組小鼠腎功能比較

圖2 4組小鼠腎組織損傷程度比較

2.3 4組小鼠腎組織纖維化的比較 與Nrf2野生型假手術(shù)組比，Nrf2野生型UUO組腎間質(zhì)總膠原累積顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Nrf2敲除型假手術(shù)組比，Nrf2敲除型UUO組的膠原累積顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組腎膠原累積顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 4組小鼠腎組織纖維化的比較

2.4 4組小鼠腎組織肌成纖維細(xì)胞活化的比較 與Nrf2野生型假手術(shù)組比，Nrf2野生型UUO組腎組織α-SMA蛋白的表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Nrf2敲除型假手術(shù)組比，Nrf2敲除型UUO組α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組α-SMA的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

2.5 4組小鼠腎組織膠原累積水平比較 與Nrf2野生型假手術(shù)組比，Nrf2野生型UUO組III型膠原蛋白的表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。Nrf2敲除型假手術(shù)組比，Nrf2敲除型UUO組III型膠原蛋白表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組III型膠原蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 4組小鼠腎組織TGF-β1表達(dá)水平比較 與Nrf2野生型假手術(shù)組比，Nrf2野生型UUO組TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Nrf2敲除型假手術(shù)組比，Nrf2敲除型UUO組TGF-β1表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除小鼠UUO組TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖4 4組小鼠腎組織肌成纖維細(xì)胞活化的比較

圖5 4組小鼠腎組織膠原累積水平比較

3 討論

核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 屬于帽和領(lǐng)（Cap'n'Collar，CNC）亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族（CNC-bZIP）成員，可通過編碼一系列抗氧化劑保護相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)氧化還原微環(huán)境，因此Nrf2成為細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的重要分子。多項研究表明，Nrf2與各種原因誘導(dǎo)的腎損傷及纖維化病變密切相關(guān)[2-4]。在鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病腎病中，Nrf2基因敲除會加劇小鼠腎損傷程度和纖維化[6]，而應(yīng)用藥物靶向提高Nrf2活性，則能減輕慢性腎損害與纖維化程度[7]。因此，Nrf2可能是人類腎臟疾病潛在的治療靶點[8]。

本研究應(yīng)用Nrf2基因敲除小鼠，通過構(gòu)建UUO模型以形成纖維化，來研究Nrf2對腎肌成纖維細(xì)胞的活化與纖維化的影響。首先，本研究評價了敲除Nrf2對腎功能的影響，發(fā)現(xiàn)敲除Nrf2并未能明顯下調(diào)腎功能。推測這一方面可能與標(biāo)本量有關(guān)，另一方面可能與對側(cè)腎的代償作用有關(guān)。其次，與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組腎損傷更明顯，總膠原累積更嚴(yán)重。深入分析，Nrf2敲除型UUO組α-SMA的表達(dá)較Nrf2野生型UUO組更高，同時III型膠原的表達(dá)也明顯增強。這些證據(jù)表明：Nrf2與腎損傷及纖維化呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)。Nrf2可能通過抑制腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低局部炎癥損傷，緩解腎肌成纖維細(xì)胞活化和膠原積聚[4]。同時，Nrf2也可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞浸潤和極化，抑制炎癥小體形成，最終影響腎纖維化進程[9]?；诖?，Nrf2可以 預(yù)防或者減輕包括砷、鉻和鎘在內(nèi)的多種重金屬引起的腎毒性[10-12]，也可以抑制免疫抑制劑環(huán)孢菌素A所致的TGF-β1表達(dá)增加，進而引起腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和間質(zhì)纖維化[13]。

圖6 4組小鼠腎組織TGF-β1表達(dá)水平比較

本研究也發(fā)現(xiàn)Nrf2 影響腎纖維化的機制與TGF-β1有關(guān)，TGF-β1是介導(dǎo)EMT最重要的誘導(dǎo)因子。對腎小管上皮細(xì)胞而言，TGF-β1可以通過細(xì)胞膜上受體TGF-β1R的介導(dǎo)，影響下游信號分子Smad2/3的磷酸化及入核表達(dá)，最終引起小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[1]。同樣，TGF-β1的作用也可以促進腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，并誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的活化。在肺纖維化模型中，敲減Nrf2可誘導(dǎo)TGF-β1介導(dǎo)的表型轉(zhuǎn)化和纖維化[14]。同樣，在糖尿病腎病中Nrf2 可抑制TGF-β1 轉(zhuǎn)錄水平，進而緩解纖維化病變[15]。Nrf2對TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是通過與轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和SP1 的相互作用，進而結(jié)合到TGF-β1啟動子的特定區(qū)域影響其轉(zhuǎn)錄[15]。本研究結(jié)果也支持了上述觀點，即Nrf2 對TGF-β1及肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的抑制作用。在構(gòu)建的UUO模型中，腎TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯升高，敲除Nrf2可加劇TGF-β1的表達(dá)。因此，TGF-β1可能是Nrf2抗腎纖維化作用重要的下游分子靶點。