潘承雙，張歡，徐芝慧，金建遠(yuǎn)，費(fèi)前進(jìn)，倪吳花

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江溫州325015）

隨著人類輔助生殖技術(shù)不斷創(chuàng)新和進(jìn)步，特別是單精子卵胞漿內(nèi)注射術(shù)（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）用于治療男性不育，配合外科附睪和睪丸取精術(shù)，使大部分既往需要通過供精或領(lǐng)養(yǎng)才有孩子的無精子癥男性不育患者有了成為生物學(xué)父親的機(jī)會(huì)。精子因素會(huì)對(duì)輔助生殖技術(shù)治療的結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。精子在通過男性生殖道時(shí)易受損傷[1]，一些研究表明，與男性因素不育癥患者（包括隱匿精子癥、畸形精子癥、重度少精子癥或嚴(yán)重弱精子癥患者）中的射精精子相比，使用睪丸精子具有更高的著床率、妊娠率和活產(chǎn)率[2-3]。對(duì)于精子DNA高損傷的試管嬰兒反復(fù)失敗患者，推薦使用睪丸精子而不是射精精子進(jìn)行ICSI[4-5]，即使精液常規(guī)參數(shù)正常[6]。

外科手術(shù)取精依據(jù)部位可有附睪取精或睪丸取精。通常取精安排在取卵當(dāng)天進(jìn)行，如果找不到精子，可行供精治療。但當(dāng)天睪丸活檢一般獲得的可注射的活動(dòng)精子較少，收集足夠注射用的精子可能需要幾個(gè)小時(shí)。有研究表明睪丸精子體外培養(yǎng)可促進(jìn)細(xì)胞分化及提高精子活動(dòng)力，并可獲得與射精精子相當(dāng)?shù)氖芫?、著床率和妊娠率，建議睪丸活檢可以在取卵前一天進(jìn)行[7]。然而，該類研究涉及例數(shù)少，且針對(duì)另一種外科取精方式（附睪活檢取精），在取卵前一天進(jìn)行的附睪活檢取精的臨床應(yīng)用和體外培養(yǎng)精子用于卵胞漿內(nèi)單精子注射的臨床結(jié)局目前尚未見有報(bào)道。本研究探討外科取精（包括睪丸取精與附睪取精）次日行ICSI治療的可行性，并評(píng)價(jià)外科手術(shù)取精時(shí)間對(duì)ICSI臨床妊娠結(jié)局的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 回顧分析2008年1月到2017年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診行外科手術(shù)取精-ICSI治療的839例新鮮周期的臨床數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：男方因無精子癥，不射精，勃起功能障礙等無法手淫獲取精液精子或精液精子活動(dòng)力差采用外科取精-ICSI助孕的患者。所有入選周期排除了女性因素（卵巢儲(chǔ)備功能下降、獲卵數(shù)小于4、嚴(yán)重染色體異常等），以及由于各種原因如：卵巢過度刺激高風(fēng)險(xiǎn)、無胚胎移植、宮腔積液、患者主觀因素等未移植新鮮胚胎者。手術(shù)的時(shí)間是根據(jù)試管嬰兒實(shí)驗(yàn)室預(yù)先確定的工作負(fù)荷來設(shè)定的，目的是在工作負(fù)荷較低的日子進(jìn)行手術(shù)，避免周末手術(shù)，并適應(yīng)醫(yī)師的需要。因此，基于這種隨機(jī)分配，形成了2組。根據(jù)取精時(shí)間與授精時(shí)間差分成取精當(dāng)日ICSI組與取精次日ICSI組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 精液檢查：所有患者禁欲2～8d，手淫方法取精。記錄禁欲時(shí)間，按照WHO精液分析手冊(cè)行精液常規(guī)檢查。無精子癥患者需反復(fù)3次以上檢查。無精液癥患者行高潮后尿液離心鏡檢，以鑒別逆行射精。

1.2.2 手術(shù)取精：患者取仰臥位，常規(guī)消毒、鋪巾，0.5%利多卡因行精索阻滯和陰囊皮膚局部浸潤(rùn)麻醉，固定一側(cè)附睪（或睪丸），采用8號(hào)針經(jīng)皮穿刺附睪（或睪丸），由助手用10mL注射器維持負(fù)壓8～10mL，直至吸取附睪液（或睪丸組織條）。

1.2.3 手術(shù)取精后精液處理：將附睪液鏡下直接觀察，密度梯度離心法制備精子；將睪丸組織放入3mLHTF-HEPES培養(yǎng)液中，將其在培養(yǎng)皿底部的井字劃痕上來回搓動(dòng)，磨碎曲細(xì)精管，鏡下觀察可見精子，組織懸液離心10min后棄上清液，加入0.2mLHTF-HEPES，獲得的睪丸組織懸液作10μL長(zhǎng)滴。

1.2.4 ICSI授精：卵子經(jīng)過透明質(zhì)酸酶（美國(guó)Sigma公司）剝除顆粒細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液滴中行ICSI。受精后16～18h，胚胎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察受精情況，見到雙原核和雙極體為正常受精。

1.2.5 胚胎質(zhì)量評(píng)估：2 組患者所獲得的成熟卵母細(xì)胞行ICSI操作，成功受精后體外培養(yǎng)至第3天（D3），結(jié)合本中心臨床操作實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)分，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。優(yōu)質(zhì)胚胎的標(biāo)準(zhǔn)[8]為：正常受精發(fā)育而來的胚胎，卵裂球數(shù)目7～9個(gè)，碎片≤15%，卵裂球無明顯大小差異，定義為I級(jí)胚胎；可移植胚胎的標(biāo)準(zhǔn)為：卵母細(xì)胞正常受精后第3天形成細(xì)胞數(shù)量≥4個(gè)且級(jí)別在II級(jí)以上的胚胎。其余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期，行冷凍保存。

1.2.6 胚胎移植和妊娠檢查：選擇評(píng)分最高的2～3枚胚胎進(jìn)行移植，剩余胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，以移植后4周陰道B超下出現(xiàn)孕囊和胎心為臨床妊娠[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用表示，2組比較采用t檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基礎(chǔ)情況 共839例外科手術(shù)取精。依據(jù)臨床診療指南[10-11]進(jìn)行患者分類，其中梗阻性無精子癥689例（占82.1%），非梗阻性無精子癥55例（占6.6%），勃起功能障礙33例（占3.9%），不射精33例（占3.9%），逆行射精9例（占1.1%），重度少精子癥13例（占1.5%），重度弱精子癥7例（占0.8%）。

2.2 2組一般情況比較 共839新鮮周期ICSI，取精當(dāng)日ICSI組396例（附睪289例，睪丸107例），取精次日ICSI組443例（附睪307例，睪丸136例）。患者年齡為27～39歲，不育年限（4.0±3.0）年，當(dāng)日ICSI組與次日ICSI組比較，2 組的不育年限、女性年齡、獲卵數(shù)、女性BMI、移植胚胎數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。胚胎體外培養(yǎng)和臨床結(jié)果顯示2組的受精率、成熟率、卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 2種取精方式臨床結(jié)局 2種取精方式（附睪、睪丸取精）當(dāng)日ICSI與次日ICSI受精率、成熟率、卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3-4。

表1 外科取精當(dāng)日ICSI組和次日ICSI組患者的生理特征

表2 外科取精當(dāng)日ICSI組和次日ICSI組胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)果（%）

表3 附睪取精當(dāng)日ICSI組和次日ICSI組胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)果（%）

表4 睪丸取精當(dāng)日ICSI組和次日ICSI組胚胎體外發(fā)育和臨床結(jié)果（%）

3 討論

輔助生殖中外科取精I(xiàn)CSI治療，通常取精安排在取卵當(dāng)天進(jìn)行，取精手術(shù)可以安全地推進(jìn)到女方取卵手術(shù)前一天[12]。采用這種做法可能會(huì)給夫妻雙方和醫(yī)療團(tuán)隊(duì)帶來一些實(shí)際的好處，其中包括：①實(shí)驗(yàn)室工作人員有足夠的時(shí)間仔細(xì)搜尋精子[13]；②更好地規(guī)劃實(shí)驗(yàn)室和手術(shù)室的活動(dòng)；③在壓力較小的條件下，夫婦有更多時(shí)間考慮使用供精的可能性，同時(shí)男性患者在配偶取卵日無需再次手術(shù)，可參與配偶取卵后護(hù)理。因此提前一天外科手術(shù)取精是臨床上可行的一種治療手段，對(duì)ICSI治療有益。

有研究表明，精子體外培養(yǎng)可促進(jìn)細(xì)胞分化及提高精子活動(dòng)力，因而建議手術(shù)取精可以在取卵前一天進(jìn)行[7]。但也有研究證實(shí)精子在體外環(huán)境培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的活性氧可能影響細(xì)胞膜流動(dòng)性和DNA穩(wěn)定性，精子DNA碎片會(huì)增加[14]，進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育潛能，從而降低臨床妊娠率和增加流產(chǎn)率[1，15]。本研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)對(duì)精子活力沒有不利影響。胚胎移植后，在數(shù)量和質(zhì)量上比較，新鮮精子和過夜培養(yǎng)精子的植入率和臨床妊娠率分別為34.4%和35.4%，這與KARACAN等[16]的研究類似。使用新獲得的精子與延長(zhǎng)培養(yǎng)的精子相比，臨床妊娠率在附睪取精組相同，睪丸取精組有5%的差異，提示睪丸精子提前一天獲取可能獲得較好的臨床結(jié)果，這可能跟體外培養(yǎng)后睪丸精子活力增強(qiáng)有關(guān)[17]，但睪丸組織體外培養(yǎng)的最佳物理和化學(xué)方法尚未確定，同時(shí)這種差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量有關(guān)。

非梗阻性無精子癥患者睪丸存在生精障礙或阻滯，對(duì)生精阻滯的精子，延遲體外培養(yǎng)時(shí)間，精子成熟度可能趨于好轉(zhuǎn)。ESTEVES等[18]能尋見精子并行ICSI的非梗阻性無精子癥精子只能在睪丸極少局灶部位被找到，因此尋找精子的難度明顯增加。一旦尋見精子并實(shí)現(xiàn)活產(chǎn)，胎齡、出生體質(zhì)量、圍產(chǎn)期死亡率和畸形率似乎不受睪丸生精功能障礙的影響[18]，但對(duì)外科取精I(xiàn)CSI的子代安全性還有待更多的人群分析持續(xù)監(jiān)測(cè)。顯微外科取精可增加精子獲取率[19-20]，對(duì)未獲得精子的非梗阻性無精子癥，以供精治療，非梗阻性無精子癥精子獲取率不在本研究范圍。非梗性無精子癥外科可獲得精子的臨床治療結(jié)局52.7%（29/55），而梗阻性無精子癥組臨床妊娠率56.0%（386/689），兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究結(jié)果提示睪丸生精功能障礙并未對(duì)ICSI治療結(jié)局有不利影響，但仍需更大樣本量證實(shí)。

GRECO等[21]研究發(fā)現(xiàn)同一患者精液精子中的DNA損傷較睪丸精子明顯增加，并認(rèn)為精子DNA損傷主要由于睪丸后的氧化應(yīng)激，因此推薦在臨床中應(yīng)優(yōu)先選擇睪丸精子行ICSI受精。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，大多數(shù)精子只有到達(dá)附睪遠(yuǎn)端后，在附睪及輸精管分泌的特定物質(zhì)的作用下才得以成熟并獲得受精的能力[22]，因此推薦在臨床中應(yīng)優(yōu)先選擇附睪精子行ICSI受精。對(duì)外科取精精子行相關(guān)檢查分析，將更有利于了解外科不同部位獲取的精子質(zhì)量，從而進(jìn)一步探討外科取精部位對(duì)輔助生殖技術(shù)的影響。遺憾的是，我們之前并未對(duì)睪丸、附睪精子行精子DNA碎片分析，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。但不管是附睪精子還是睪丸精子，當(dāng)日授精與次日授精在受精率、成熟率、卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，外科取精時(shí)間并不影響輔助生殖臨床結(jié)果。

綜上所述，無論是采用附睪精子還是睪丸精子，提前一天手術(shù)取精并未對(duì)ICSI結(jié)局有顯著影響。但由于本研究樣本量小，局限于胚胎早期發(fā)育和臨床妊娠方面，缺少附睪和睪丸精子DNA碎片分析結(jié)果，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。