王德選，王萬鐵，鄭綠珍，陳偉偉，楊青，莊捷秋，許益笑，

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院小兒腎內(nèi)科，浙江溫州325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，浙江溫州325035）

我國白血病年發(fā)病率為3～4/10萬，且呈逐年增加趨勢(shì)[1]。目前白血病治療方式主要有化療、藥物靶向治療、骨髓和干細(xì)胞移植等，取得了一定的治愈和緩解效果，但存在不同程度的化療藥物耐藥及不良反應(yīng)、移植配型困難、費(fèi)用高昂等缺點(diǎn)。因此，在原有治療基礎(chǔ)上，探索一些安全有效的輔助治療方法顯得極為重要。

金絲桃素（hypericin）是植物貫葉連翹提取物的主要活性成分之一，臨床上已作為抗病毒、抗抑郁藥物應(yīng)用多年，具有很高的藥物安全性[2-3]。另外金絲桃素作為一種天然光敏劑，還具有低光照下毒性低和光依賴性抗腫瘤活性強(qiáng)的雙重特點(diǎn)，可對(duì)較多實(shí)體腫瘤實(shí)施光動(dòng)力學(xué)治療作用[4]。金絲桃素容易被白細(xì)胞等有核血液細(xì)胞攝取，但封閉血管系統(tǒng)中流動(dòng)的各種血細(xì)胞都無法直接照射，也限制了金絲桃素介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法（hypericinmediated photodynamic therapy，Hyp-PDT）在血液系統(tǒng)疾病的應(yīng)用。本課題組研制了倒置可調(diào)功率光動(dòng)力學(xué)照射平臺(tái)，通過體外循環(huán)實(shí)施Hyp-PDT（另文發(fā)表）并研究其相關(guān)機(jī)制。本研究主要探索Hyp-PDT對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞株的殺傷作用及對(duì)自噬通路的影響，希望為Hyp-PDT引入外周血白血病的治療提供理論驗(yàn)證，改善白血病患者的健康。

1 材料和方法

1.1 材料 K562 細(xì)胞株購自上海生科院細(xì)胞資源中心；高純度金絲桃素購自美國Sigma公司。CCK-8分析試劑盒購于日本Dojindo Laboratories；Beclin-1、LC3 及Akt兔多克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司；二抗為美國Jackson ImmunoResearch公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基RPMI1640購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中添加100μg/mL鏈霉素和lOOU/mL青霉素，培養(yǎng)箱條件為5%CO2，37℃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在超凈臺(tái)暗環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞分組，細(xì)胞密度調(diào)整為約5×105個(gè)/mL。

1.3 光動(dòng)力學(xué)干預(yù)及CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活性 將K562細(xì)胞懸液分為3組接種于96孔板：金絲桃素組培養(yǎng)液中含0.4μg/mL金絲桃素及DMSO助溶劑；正常細(xì)胞組培養(yǎng)液中添加等體積0.9%氯化鈉溶液；DMSO組培養(yǎng)液中含有等體積DMSO。每孔含培養(yǎng)液100μL。避光孵育4h，用0.3mW/cm2的光強(qiáng)度（預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的最佳光照強(qiáng)度）對(duì)樣品照射4min。

10μLCCK-8溶液分別于光照前、光照后5min、4h、8h和16h不同時(shí)間點(diǎn)加入每孔培養(yǎng)液中（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5孔）。每個(gè)96孔板空白對(duì)照孔均加入等量CCK-8溶液、藥物以及不含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)避光孵育1h后測(cè)定每孔的吸光度值（OD值），酶標(biāo)儀測(cè)定波長為450nm。

細(xì)胞活力=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100%。A（加藥）：每孔含細(xì)胞、金絲桃素培養(yǎng)液的OD值。A（空白）：每孔含金絲桃素培養(yǎng)液而無細(xì)胞的OD值。A（0加藥）：每孔含細(xì)胞及培養(yǎng)液，但無金絲桃素的OD值。

1.4 光動(dòng)力學(xué)干預(yù)前后K562細(xì)胞形態(tài)及自噬體數(shù)量變化 在6cm培養(yǎng)皿中加入濃度為0.4μg/mL的金絲桃素培養(yǎng)液及K562細(xì)胞懸液，避光孵育4h，以主波為595nm波長的LED燈照射4min，細(xì)胞位置光強(qiáng)度為0.3mW/cm2。顯微鏡下觀察照射前、照射后8h、照射后16h細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。另設(shè)未加金絲桃素的細(xì)胞作為對(duì)照（DMSO組）。

細(xì)胞分組及干預(yù)同上，在照射前、照射后8h收集細(xì)胞懸液，經(jīng)1200r/min離心10min，棄上清液，細(xì)胞團(tuán)與2.5%戊二醛液充分混勻固定，經(jīng)過漂洗、塊染、梯度脫水、包埋等常規(guī)步驟，制成厚度約80nm的切片，枸櫞酸鉛-30%醋酸鈾雙染色，透射電鏡（JEM-l00CXII）下觀察自噬體數(shù)量。

1.5 Western blot測(cè)定Hyp-PDT對(duì)K562細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響 細(xì)胞分組及干預(yù)同1.4。于光照前即刻，光照后4、8、16h離心收集細(xì)胞懸液，細(xì)胞裂解（RIPA液）后低溫下15000r/min離心15min，取上清液待用。各組蛋白濃度配平后將樣品與預(yù)熱的6×Loading充分混勻，100℃水浴5min。每孔添加40μg蛋白樣品后進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，濃縮膠電壓70mV，分離膠電壓120mV。冰浴下恒流轉(zhuǎn)膜（300mA）90min，依次一抗孵育4℃過夜（稀釋濃度均為1:1000）、二抗室溫孵育2h（稀釋濃度1:12000），ECL顯色。使用Bio-Rad顯像儀收集圖像，并用附帶軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行量化分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；多重比較，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hyp-PDT對(duì)K562細(xì)胞活性的影響 0.3mW/cm2光照強(qiáng)度下4min后，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常細(xì)胞組、DMSO組光照前后細(xì)胞活性無明顯變化，且2組間在同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），提示光照對(duì)K562細(xì)胞活性無明顯影響。金絲桃素組光照后細(xì)胞活性隨時(shí)間延長逐漸降低，與光照前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），且與正常細(xì)胞組、DMSO組比，所有時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性均顯著降低（均P＜0.01），見表1。

表1 0.3mW/cm2光照強(qiáng)度下各組K562細(xì)胞活性比較（每組n=5，%）

2.2 Hyp-PDT對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)的影響 DMSO組和金絲桃素組光照前細(xì)胞在相差顯微鏡下呈現(xiàn)為孤立性或者集落性分布的半透明球狀細(xì)胞，邊界清晰，折光性強(qiáng)（見圖1A和1D）。Hyp-PDT干預(yù)后，細(xì)胞生長變慢，部分細(xì)胞不能貼壁生長，細(xì)胞的集落生長規(guī)律被破壞，可觀察到大量細(xì)胞邊界模糊，胞質(zhì)空泡化，折光性顯著下降，亦有部分細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變性甚至溶解破裂（見圖1B和1C）。

圖1 相差顯微鏡觀察Hyp-PDT對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響（×400，箭頭所示為空泡化及嚴(yán)重變形的K562細(xì)胞）

2.3 Hyp-PDT對(duì)K562細(xì)胞自噬小體的影響 電鏡顯示：在DMSO組及金絲桃素組照射前收集的K562細(xì)胞中可觀察到具有典型的雙層或多層膜結(jié)構(gòu)，膜內(nèi)包含細(xì)胞器或者胞漿成分的自噬體（見圖2A和2C），DMSO組光照后8h胞漿內(nèi)自噬體數(shù)量較前增多（見圖2B），但金絲桃素組光照后8h自噬體幾不可見（見圖2D）。

2.4 Hyp-PDT對(duì)K562細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響 免疫印跡結(jié)果顯示：與照射前比較，金絲桃素組照射后8h和16h的LC3蛋白表達(dá)量明顯下降，DMSO組LC3蛋白含量則略有升高（P＜0.05）；金絲桃素組的Beclin-1蛋白在光照后16h時(shí)與DMSO組比較出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），同期p-Akt蛋白表達(dá)量也明顯減少（P＜0.05），但總Akt表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3-4。

3 討論

國內(nèi)外近年來的研究表明Hyp-PDT對(duì)較多腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷作用，例如可誘導(dǎo)約94%的皮膚T細(xì)胞惡性淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)[5]。本研究結(jié)果表明，在光強(qiáng)度為0.3mW/cm2條件下，Hyp-PDT可顯著降低K562細(xì)胞的活性，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，部分細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變性甚至溶解破裂，表明Hyp-PDT對(duì)白血病細(xì)胞也有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性作用。

圖2 電鏡下K562細(xì)胞的自噬改變（箭頭所示為自噬體）

適度的自噬有助于腫瘤細(xì)胞生存，減少發(fā)生凋亡的可能[6]。腫瘤細(xì)胞面臨缺氧、藥物作用等不利因素時(shí)，細(xì)胞質(zhì)成分進(jìn)入自噬途徑降解為細(xì)胞可以重新利用的氨基酸等原料，有助于細(xì)胞存活；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)老化及受損的細(xì)胞器和無功能蛋白質(zhì)可通過自噬途徑清除，維持細(xì)胞DNA穩(wěn)定性，避免發(fā)生凋亡，這是臨床上抗癌治療出現(xiàn)耐藥性的原因之一[7]。但自噬過強(qiáng)會(huì)引起胞漿成分被大量降解，同時(shí)自噬溶酶體酶可剪切激活某些促凋亡因子，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序；而自噬受到過度抑制也會(huì)導(dǎo)致胞漿內(nèi)容物清除障礙，引起腫瘤細(xì)胞死亡[7]。

急性白血病的相關(guān)研究表明，細(xì)胞內(nèi)自噬可促進(jìn)白血病細(xì)胞存活與增殖[8]，由于包括白血病在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞常常存在自身凋亡機(jī)制失效，故腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞更加依賴自噬的調(diào)節(jié)作用[9]，提示抑制自噬可能有助于急性白血病的治療。本研究觀察到，K562細(xì)胞在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)典型的自噬體，且在光照后增多，Westernblot結(jié)果顯示，自噬相關(guān)LC3蛋白的表達(dá)量在光照后8h和16h也有所增加，證明白血病K562細(xì)胞中存在自噬現(xiàn)象，而增多的自噬體可能是白血病細(xì)胞應(yīng)對(duì)營養(yǎng)供應(yīng)減少、細(xì)胞器受損等情況出現(xiàn)的自身保護(hù)現(xiàn)象。

LC3 蛋白多表達(dá)在自噬體及與前自噬體膜上，為常見自噬體標(biāo)志物，觀察LC3蛋白表達(dá)水平變化可以間接確認(rèn)自噬程度的情況[10]。另外自噬前體結(jié)構(gòu)的重要自噬蛋白Beclin-1可介導(dǎo)自噬小泡的成熟，調(diào)節(jié)自噬活性，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道Beclin-1 基因敲除后的小鼠細(xì)胞自噬減少，其肝癌、肺癌的發(fā)病率顯著提升[11]。有報(bào)道提出光動(dòng)力治療產(chǎn)生的活性氧可以誘導(dǎo)自噬[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃素組在0.3mW/cm2光照射后8h和16h時(shí)的LC3蛋白表達(dá)顯著減少，光照后16hBeclin-1表達(dá)量也出現(xiàn)下調(diào)。電鏡下亦觀察到光照后金絲桃素組的自噬體顯著減少，自噬蛋白水平的變化與自噬體數(shù)量的變化相一致。以上結(jié)果提示實(shí)施Hyp-PDT可抑制白血病K562細(xì)胞的自噬。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到p-Akt蛋白表達(dá)的同步下降，則提示Hyp-PDT誘導(dǎo)的自噬改變可能與PI3K-Akt通路有關(guān)[12]。

綜上所述，Hyp-PDT可能通過抑制Akt磷酸化，減少K562自噬，促進(jìn)細(xì)胞死亡，起到殺傷白血病腫瘤細(xì)胞的作用。