梁莎莎，龐春英，鄧廷賢，馬小婭，陸杏蓉，段安琴，梁賢威

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

水牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富，其乳脂肪、乳蛋白等主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均高于牛奶或人奶[1]，被譽(yù)為“奶中之王”。乳脂是乳中重要組成成分，由約98%的甘油三酯和約1%的磷脂、少量的1,2-甘油二酯、膽固醇和游離脂肪酸等組成[2]。長(zhǎng)鏈脂酞輔酶A 合成酶家族（Long-Chain Fatty Acyl-CoA synthetases，ACSLs）是哺乳動(dòng)物利用脂肪酸活化催化生成酯酰輔酶A 過程中所必需的酶[3]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物ACSLs基因有5 種亞型，分別為ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6[4-5]。研究表明，ACSLs基因在甘油三酯、磷脂和膽固醇合成及脂肪酸代謝中具有重要作用[6]。Suzuki 等[7]和Abe等[8]研究發(fā)現(xiàn)高碳水化合物或高脂肪日糧會(huì)對(duì)ACSL1在肝臟中的表達(dá)產(chǎn)生影響。Hendrik 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ACSL1在出生后至成年過程中的表達(dá)量逐漸增加。在HepG2 細(xì)胞中，過表達(dá)ACSL1導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量增加了40%，并且長(zhǎng)鏈脂酞輔酶A 含量也增加了60%[10]。因此，ACSL1基因過表達(dá)后可以提高甘油三酯中油酸的沉積，增加脂肪在細(xì)胞內(nèi)的沉積量[3]，而脂肪的沉積可影響奶的風(fēng)味[11]。鑒于此，探究ACSL1基因?qū)χx相關(guān)基因表達(dá)水平的影響對(duì)未來生產(chǎn)出高品質(zhì)水牛奶具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)利用基因操作技術(shù)克隆出水牛ACSL1完整CDS 序列并構(gòu)建過表達(dá)載體和干擾片段，從而探究該基因?qū)θ橄偕掀ぜ?xì)胞中乳脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，為今后進(jìn)一步研究該基因在奶水牛乳腺脂肪酸代謝中的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 3 頭48 月齡、體重約500 kg 的雌性泌乳期尼里水牛來自廣西水牛研究所種畜場(chǎng)，原代分離和培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑 骨架載體PCDNA3.1+、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、DMEM/F-12 細(xì)胞培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000、Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑和PowerUp SYBR Green Master Mix 購(gòu)自Thermo 公司；普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；PEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；PureLink RNA Mini Kit、PremixTaq酶購(gòu)自TaKaRa 公司，siRNA 干擾片段委托廣州銳博生物科技有限公司制備（表1）。

表1 siRNA 序列

1.3ACSL1不同組織表達(dá)量檢測(cè) 將水牛的共8 種組織的cDNA 稀釋至70～80 ng/μL，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACSL1在不同組織中的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20 μL，其中PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，Rnase water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL；反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.4ACSL1基因編碼區(qū)克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建 采用一步克隆法設(shè)計(jì)引物，以NCBI 上預(yù)測(cè)的水牛ACSL1基因（登錄號(hào)：XM_006075115.2）為參考序列，以pcDNA3.1+為骨架載體，選取NotⅠ為酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增引物：F:5′-ATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCATGATGCAA GCCCACGAGC-3′；R：5′-GCCCTCTAGACTCGAGCG GCCGCTTAGACTTTGATGGTGGAG-3′。大體上講，以水牛乳腺組織cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體 系50 μL：DNA 模 板1 μL，PremixTaq25 μL，上、下游引物各2 μL，dH2O 20 μL；PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min。取10 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收后，產(chǎn)物與pcDNA3.1+載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選挑菌培養(yǎng)后，委托華大基因進(jìn)行測(cè)序。

1.5 水牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM+10%FBS，轉(zhuǎn)染前24 h，將水牛乳腺上皮細(xì)胞均勻接種于24 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染ACSL1過表達(dá)載體，使用Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染siRNA，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置過表達(dá)載體組（Ad-ACSL1）、過表達(dá)載體對(duì)照組（Ad-pcDNA3.1+）、干擾組（siRNA-ACSL1）和干擾對(duì)照組（siRNA-NC）4個(gè)處理組，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)置3個(gè)孔。

1.6ACSL1過表達(dá)及干擾對(duì)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后收集，用PureLink RNA Mini Kit 試劑盒提取總RNA，通過電泳檢測(cè)RNA 的濃度和完整性，再使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 模板1 μL，nuclease-free water 10 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，dNTP Mix 2 μL，RiboLock 1 μL，RevertAid 1 μL，Oligo(dT) 1 μL，42℃ 60 min，cDNA 保存于-80℃。

用Primer 3.0 在線軟件設(shè)計(jì)脂代謝相關(guān)基因，其引物序列見表2。qPCR 反應(yīng)體系為20 μL：PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，Rnase water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL；反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR 引物

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad Prism 7 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析及作圖，運(yùn)用t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。將P≤0.05 作為顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 水牛ACSL1基因組織表達(dá)分析 由圖1 可知，水牛ACSL1基因在乳腺組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織，其他組織的表達(dá)量從高到低依次為乳腺、淋巴、肝、心、大腸、腎、肺、垂體、子宮、輸卵管、卵巢、脾和大腦。

2.2 水牛ACSL1基因CDS 序列克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建以水牛乳腺組織cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，出現(xiàn)了1 個(gè)單一DNA條帶，片段大小為2 100 bp，與預(yù)測(cè)的片段大小一致（圖2），經(jīng)測(cè)序后與模板序列比對(duì)，相似性達(dá)99.95%；以pcDNA3.1+為骨架載體，選取NotⅠ為酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選挑菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒（圖3）。

2.3ACSL1過表達(dá)對(duì)脂代謝相關(guān)基因的影響 如圖4 所示，與對(duì)照組（Ad-pcDNA3.1+）相比實(shí)驗(yàn)組（Ad-ACSL1）細(xì)胞中ACSL1表達(dá)量極顯著上升(P＜0.001)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染ACSL1過表達(dá)載體與對(duì)照組差異極顯著。由圖5 可知，ACSL1基因過表達(dá)后，細(xì)胞中CLIC1、ELOVL1和PNPLA2等3 個(gè)基因顯著上升、ELOVL6表達(dá)量則極顯著上升，而CPT1B、CPT1C和DDR1表達(dá)量極顯著上升（P＜0.001），但FADS2差異不顯著。

2.4ACSL1干擾對(duì)脂代謝相關(guān)基因的影響 如圖6 所示，與對(duì)照組（siRNA-NC）相比，實(shí)驗(yàn)組（siRNA-ACSL1）細(xì)胞中ACSL1表達(dá)量極顯著下降(P＜0.01)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染ACSL1干擾片段及其對(duì)照后的表達(dá)情況。由圖7 可知，ACSL1基因敲低后，細(xì)胞中ELOVL1和FADS2表達(dá)量顯著下降，而CLIC1、CPT1C、ELOVL6、DDR1和PNPLA2表達(dá)量極顯著下降，但CPT1B差異不顯著。

3 討 論

長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A 合成酶家族（ACSLs）是脂肪酸代謝中至關(guān)重要的酶，它們以長(zhǎng)鏈脂肪酸（C12-C22）、ATP 和COA 作為底物，生成長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A 酯而參與各種脂類代謝[12]。ACSLs 基因家族的成員在不同組織中的表達(dá)及作用各不相同[13]，ACSL1一般在與能量代謝有關(guān)的組織（如肝臟、脂肪和肌肉組織）中高表達(dá)[14]，在對(duì)人HepG2 細(xì)胞、小鼠原代肝細(xì)胞、肝臟組織、脂肪細(xì)胞以及脂肪組織的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ACSL1有助于脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和甘油三酯的沉積[15-17]，并且ACSL1是脂酰CoA 合成甘油三酯最重要的合成酶[14]。Bionaz 等[18]發(fā)現(xiàn)，ACSL1基因奶牛泌乳高峰期乳腺中的表達(dá)量極顯著上升，乳汁中甘油三酯水平也急劇上升。本研究的組織表達(dá)分析結(jié)果也進(jìn)一步顯示，該基因在乳腺組織中的表達(dá)量最高，暗示該基因可能與泌乳期水牛乳脂合成有關(guān)。

在奶牛乳腺組織中，乳脂合成的主要過程為脂肪酸的分解與攝入、脂肪酸的激活與轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸的合成、三酰甘油的合成、乳脂滴形成和乳脂合成相關(guān)的調(diào)節(jié)因子[19]。CPT1B和CPT1C是CPT1家族中十分重要的成員，CPT1B參與脂肪酸的分解供能調(diào)控，CPT1C是脂肪酸分解代謝主要途徑β-氧化的限速酶[20]，CPT1能催化脂酰輔酶A 生成脂酰肉毒堿，通過調(diào)節(jié)長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β-氧化，從而為機(jī)體提供能量，并減少脂肪沉積[21]。過表達(dá)ACSL1后，CPT1B基因表達(dá)量均極顯著上升，因此推測(cè)，在水牛乳脂合成過程中，隨著ACSL1表達(dá)量上升，有可能使脂肪酸分解供能的活動(dòng)增加。FADS2是多不飽和脂肪酸合成過程中的限速酶，敲除FADS2基因小鼠體格比野生型小鼠小10%～15%，體重瘦20%～25%[22]。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)干擾ACSL1后，F(xiàn)ADS2表達(dá)量顯著下降。由此推測(cè)，隨著ACSL1基因表達(dá)量下降，有可能影響多不飽和脂肪酸的合成。DDR1的功能與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，是乳腺導(dǎo)管形態(tài)發(fā)生過程中結(jié)構(gòu)上皮的關(guān)鍵介質(zhì)，DDR1基因敲除小鼠表現(xiàn)為胚胎植入和乳腺發(fā)育缺陷[23]。CLIC1參與細(xì)胞跨膜物質(zhì)的運(yùn)輸，ELOVL1和ELOVL6參與脂肪酸的延伸，PNPLA2作用于催化脂肪細(xì)胞中甘油三酯脂解的起始步驟，將甘油三酯轉(zhuǎn)化為二酰甘油，PNPLA2基因敲除的小鼠由于脂肪細(xì)胞甘油三酯水解的速率受損，脂肪組織質(zhì)量增加[24]。本研究中，無論過表達(dá)或干擾ACSL1，CLIC1、CPT1C、ELOVL1、ELOVL6、DDR1和PNPLA2的表達(dá)量都隨之極顯著上升和下降。因此推測(cè)，ACSL1在乳腺上皮細(xì)胞的表達(dá)量多少有可能影響水牛乳腺的生長(zhǎng)發(fā)育狀況、水牛乳脂合成過程中乳腺細(xì)胞跨膜物質(zhì)運(yùn)輸、脂肪酸分解代謝、減少脂肪酸延伸，降低細(xì)胞中甘油三酯水解速率。綜上所述，ACSL1基因可影響水牛乳腺上皮細(xì)胞中部分脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)量變化，從而影響水牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯的合成。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了水牛ACSL1過表達(dá)載體并合成了干擾片段。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示水牛ACSL1基因在乳腺組織中的表達(dá)量最高；在乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)和干擾ACSL1后結(jié)果顯示，ACSL1基因可影響水牛乳腺上皮細(xì)胞中部分脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)量變化。本研究為進(jìn)一步探討水牛及其他物種ACSL1基因的功能提供了理論基礎(chǔ)。