余 然 李 瑞 閻春暉 牛浩強(qiáng)

河南師范大學(xué)，河南新鄉(xiāng)453000

腸道病變是一種已被世界衛(wèi)生組織列為具有挑戰(zhàn)性的病癥，腸道的患病主要與微生物、寄生蟲(chóng)、病毒感染、遺傳、自身免疫反應(yīng)、神經(jīng)精神等因素有較大關(guān)聯(lián)[1]。在實(shí)際試驗(yàn)中可用DSS（葡聚糖硫酸鈉）來(lái)創(chuàng)建結(jié)腸炎模型[2]。對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)，一旦動(dòng)物患有腸道疾病將給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大損失，不僅會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物飼養(yǎng)期延長(zhǎng)，產(chǎn)量下降，而且病情極易反復(fù)，為養(yǎng)殖工作帶來(lái)巨大隱患。針對(duì)腸道疾病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害性，研制出一種有效的治療或防御結(jié)腸炎的藥物意義重大。而傳統(tǒng)的治療腸道疾病的藥物主要為化學(xué)藥劑或者激素制劑，如潑尼松等，甚至是抗生素治療。傳統(tǒng)藥物的使用容易帶來(lái)各種各樣的副作用，如使用化學(xué)藥劑容易造成胃腸道損傷，出現(xiàn)拉稀、消化不良、食欲降低、腸道平滑肌松弛、蠕動(dòng)緩慢甚至出現(xiàn)出血性損傷，使動(dòng)物生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，料比下降；藥源性肝損傷，肝臟是解毒器官，同時(shí)也導(dǎo)致藥物中的毒素主要作用于肝臟，出現(xiàn)肝損傷[3]。而由于長(zhǎng)期的不科學(xué)、不合理地使用，甚至違規(guī)添加，導(dǎo)致了耐藥性問(wèn)題和肉中抗生素殘留超標(biāo)問(wèn)題。抗生素在消滅病菌的同時(shí)，也消滅了對(duì)動(dòng)物機(jī)體有益生理性細(xì)菌，破壞腸道微生態(tài)平衡，使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生了抗藥性細(xì)菌，危害食用者身體健康[4]。2015年9月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告，禁止在食用動(dòng)物中使用如洛美沙星等4 種抗生素，2020年飼料將全面禁抗。因此，無(wú)抗養(yǎng)殖將是大勢(shì)所趨。

在眾多替代抗生素的治療方案中，益生菌療法是有效治療腸道疾病的重要方案之一。研究表明[5]，腸道微生物菌群分布情況可影響個(gè)體健康狀況，腸道內(nèi)的益生菌可以創(chuàng)造極端環(huán)境或者分泌相關(guān)因子掌控有害菌的存活繁衍。選用無(wú)耐藥性的益生菌不會(huì)帶來(lái)化學(xué)污染，或者腸胃腎臟肝臟損傷，也不會(huì)堆積在體內(nèi)造成殘留，故而使用益生菌治療結(jié)腸炎具有巨大現(xiàn)實(shí)意義，本研究采用多種混合菌種制成EM 菌劑來(lái)改善治療結(jié)腸炎。本研究選用這6 種微生物及其原因：地衣芽胞桿菌是需氧型益生菌，使用后可以讓其進(jìn)入腸道中搶奪氧氣以此來(lái)制造無(wú)菌環(huán)境，促進(jìn)腸道內(nèi)其他正常厭氧菌的生存而且可以抑制有害細(xì)菌的繁殖[6]；凝結(jié)芽孢桿菌主要生存空間位于結(jié)腸和盲腸中，服用后會(huì)在結(jié)腸和盲腸中生存與大量繁殖，且隨其生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大量于機(jī)體有益的和可以抗菌的小分子物質(zhì)[7]；德氏乳桿菌保加利亞亞種與釀酒酵母可分別大量產(chǎn)生乳酸和二氧化碳；屎腸球菌可以抑制腸道菌群菌氨的產(chǎn)生，降低腸道內(nèi)pH，使有害菌無(wú)法生存；丁酸梭菌具有高效的調(diào)理腸道的作用，可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物菌落平衡，促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌群增殖[8]，減少毒性分子胺類和硫化氫等的產(chǎn)生，從而降低各種疾病的發(fā)生[9]。為了研究上述組合的EM 菌在動(dòng)物腸道疾病修復(fù)中的作用，本研究以小鼠腸道為模型，采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠腸道發(fā)生病變，并用EM 菌修復(fù)小鼠腸道，檢測(cè)小鼠體重、免疫酶活力、肛門(mén)便血情況以及腸道結(jié)構(gòu)變化，從而探索EM 菌對(duì)小鼠腸道病變的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）試驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠。

2）藥物與試劑：EM 菌劑、多聚甲醛粉末、液體石蠟、堿性磷酸酶（AKP）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）試劑盒、葡聚糖硫酸鈉（DSS）。

3）儀器：高速冷凍離心機(jī)、電動(dòng)切片機(jī)、分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、蠟箱、液氮罐、-80 ℃冰箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1）DSS 濃度的確定[10]。本試驗(yàn)?zāi)康脑谟跈z測(cè)EM菌劑中6 種菌是否對(duì)患有結(jié)腸炎的小鼠有緩解治療作用，故首先需要得到小鼠的腸道病變模型。選取12 只昆明小鼠（體重（30±3）g），分為3 組，每組4只，分別用3%、4%、5%的葡聚硫酸鈉混水代替清水喂食3 組小鼠，每天早上08:00 給藥，期間不給清水，其他喂養(yǎng)條件正常，每天觀察小鼠精神狀態(tài)及體重變化，7 d 后解剖觀察腸道形態(tài)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的DSS 濃度，建立小鼠腸道病變模型。

2）EM 菌修復(fù)小鼠腸道病變。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適濃度的DSS 為小鼠給藥，且根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)試驗(yàn)如下：將24 只昆明小鼠（30±3）g 分為3 組，每組8 只，分別為正常組、EM 菌組、自然恢復(fù)組，將3 組小鼠在同樣室溫下飼養(yǎng)。將EM 菌組、自然恢復(fù)組小鼠每天17:00 給予DSS 混水飲服，給藥飲服7 d，待其發(fā)??；正常組小鼠每天17:00 給予正常清水。EM 菌組小鼠發(fā)病后開(kāi)始給EM 菌治療，每天17:00 飲服5 mL EM 菌液，設(shè)恢復(fù)期為7 d，觀察恢復(fù)期內(nèi)小鼠生理形態(tài)變化。將自然恢復(fù)組小鼠發(fā)病后不給予藥物治療，讓其根據(jù)自身免疫力自然恢復(fù)，觀測(cè)其與EM 菌組小鼠的生理變化差別。且試驗(yàn)在第7 天、第14 天用摘眼球取血法分別各自采集正常組、EM 菌組、自然恢復(fù)組小鼠的血液，靜置凝固后，低溫離心，取上層血清待測(cè)，解剖取出肝臟液氮封存待測(cè)，將血清、肝臟分別按照試劑盒給定說(shuō)明書(shū)方法用分光光度計(jì)測(cè)小鼠堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）的酶活性。取出結(jié)腸處理包埋，于切片機(jī)上制8 μm 石蠟橫切切片[11]，并且在試驗(yàn)期間每天觀察和記錄小鼠的各種身體狀況變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSS 濃度對(duì)小鼠腸道病變的影響

分別采用不同濃度的DSS 喂食小鼠，結(jié)果顯示（圖1），采用3%的DSS 喂食小鼠，解剖后觀察發(fā)現(xiàn)腸道出現(xiàn)變化，腸道內(nèi)壁微微發(fā)炎，但無(wú)明顯血便，毛色暗淡，無(wú)明顯怕冷發(fā)抖癥狀，且停藥后很快恢復(fù)正常，故3% DSS 濃度不符合試驗(yàn)需要，排除3%DSS 濃度攻毒；4% DSS 濃度的小鼠攻毒4 d 后出現(xiàn)血便，毛色暗淡，小鼠行動(dòng)不再活躍，且不停發(fā)抖，單個(gè)小鼠時(shí)喜歡往木屑里藏，有明顯怕冷現(xiàn)象，飲水飲食量明顯下降，7 d 后解剖發(fā)現(xiàn)腸道有明顯發(fā)炎現(xiàn)象；5%持續(xù)1 周后全部死亡，判斷5%濃度過(guò)大，排除5%的濃度，故根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果決定正式試驗(yàn)選用4%的DSS 來(lái)攻毒昆明小鼠，建造小鼠結(jié)腸炎模型。

2.2 小鼠體重及肛門(mén)便血情況變化

圖1 DSS 濃度對(duì)小鼠腸道形態(tài)的影響

各組小鼠體重及肛門(mén)便血情況如圖2 和圖3所示，可知正常組的小鼠體重在飼養(yǎng)期間不停地上升，而給DSS 組的小鼠前3 d 體重變化不明顯，3 d后體重開(kāi)始大幅下降，并且肛門(mén)較正常小鼠顏色深，從淺粉色變?yōu)樯罴t色，糞便顏色也稍有變化，較之前糞便顏色變深發(fā)黑。隨給DSS 時(shí)間延長(zhǎng)，個(gè)別小鼠便血愈發(fā)嚴(yán)重，出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象，且小鼠精神萎靡不振。7 d 后未給EM 菌的自然恢復(fù)組小鼠便血越發(fā)嚴(yán)重，且在停止給DSS 后的4 d 內(nèi)全部死亡；而給EM 菌的試驗(yàn)組小鼠有部分便血過(guò)于嚴(yán)重的在給EM 菌第2 天就已經(jīng)死亡，其余小鼠在給EM 菌的前2 d 體重持續(xù)下降或維持不變，后期體重略有回升，第10 天開(kāi)始部分小鼠停止血便，但其中2 只在給EM 菌的第5 天和第6 天相繼死亡，死亡時(shí)已停止血便。

圖2 試驗(yàn)過(guò)程中小鼠體重的變化

2.3 小鼠免疫酶活力變化

根據(jù)圖4 可知血清堿性磷酸酶、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在給DSS 期間均在不斷上升，但給EM 菌后血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清堿性磷酸酶、肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶都開(kāi)始以不同幅度下降。有研究表明[12-14]，堿性磷酸酶可以緩解小鼠腸道病變，故在給DSS 誘導(dǎo)小鼠患病時(shí)，由于小鼠自身免疫力促進(jìn)小鼠分泌合成堿性磷酸酶，所以測(cè)得的小鼠堿性磷酸酶活性不斷升高，后期由于給予EM 菌緩解治療小鼠的腸道病變，所以小鼠體內(nèi)的堿性磷酸酶活性下調(diào)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶多分泌于肝臟受損時(shí)[15]，隨著給DSS 時(shí)間增長(zhǎng)，小鼠的肝臟也受到了一定損傷，肝臟細(xì)胞通透性增加，從肝臟滲透到血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶增多，后期隨著小鼠逐漸恢復(fù)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性下降，但并未恢復(fù)到正常水平，同時(shí)解剖后的小鼠肝臟也證明了肝臟有受傷后恢復(fù)現(xiàn)象，從圖5中可以看到由于肝界板破壞，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生包繞壞死組織形成的局限性壞死，呈白色顆粒狀[16]。

圖3 試驗(yàn)過(guò)程中小鼠肛門(mén)及糞便變化

圖4 小鼠酶活力變化

圖5 小鼠肝臟變化

2.4 小鼠腸切片觀察

從圖6 中可以明顯看出，經(jīng)由DSS 攻毒后的腸道損傷嚴(yán)重，腸道上的絨毛幾乎消失，且腸壁變薄，而給EM 菌恢復(fù)后的腸道開(kāi)始好轉(zhuǎn)，腸壁明顯變厚，且有部分腸道絨毛重新出現(xiàn)，由此可見(jiàn)EM 菌對(duì)于結(jié)腸炎的恢復(fù)具有一定作用。

3 結(jié)論

4%的DSS 連續(xù)喂食小鼠可以很好地建立腸道病變模型，小鼠在停藥后病情依然持續(xù)加重，很快出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。而在腸道發(fā)生病變后，及時(shí)喂食EM菌，小鼠的體重逐步恢復(fù)、免疫酶活力幾乎恢復(fù)正常、腸道內(nèi)壁結(jié)構(gòu)也與正常小鼠相似，小鼠死亡率大大降低。因此，EM 菌在腸道病變的修復(fù)方面具有顯著作用，該結(jié)果為EM 菌在動(dòng)物腸道疾病治療方面的應(yīng)用提供了重要依據(jù)。

圖6 小鼠腸切片