余 然 李 瑞 閻春暉 牛浩強

河南師范大學，河南新鄉(xiāng)453000

腸道病變是一種已被世界衛(wèi)生組織列為具有挑戰(zhàn)性的病癥，腸道的患病主要與微生物、寄生蟲、病毒感染、遺傳、自身免疫反應、神經(jīng)精神等因素有較大關(guān)聯(lián)[1]。在實際試驗中可用DSS（葡聚糖硫酸鈉）來創(chuàng)建結(jié)腸炎模型[2]。對于養(yǎng)殖業(yè)來說，一旦動物患有腸道疾病將給養(yǎng)殖戶帶來巨大損失，不僅會導致動物飼養(yǎng)期延長，產(chǎn)量下降，而且病情極易反復，為養(yǎng)殖工作帶來巨大隱患。針對腸道疾病對養(yǎng)殖業(yè)的危害性，研制出一種有效的治療或防御結(jié)腸炎的藥物意義重大。而傳統(tǒng)的治療腸道疾病的藥物主要為化學藥劑或者激素制劑，如潑尼松等，甚至是抗生素治療。傳統(tǒng)藥物的使用容易帶來各種各樣的副作用，如使用化學藥劑容易造成胃腸道損傷，出現(xiàn)拉稀、消化不良、食欲降低、腸道平滑肌松弛、蠕動緩慢甚至出現(xiàn)出血性損傷，使動物生長期延長，料比下降；藥源性肝損傷，肝臟是解毒器官，同時也導致藥物中的毒素主要作用于肝臟，出現(xiàn)肝損傷[3]。而由于長期的不科學、不合理地使用，甚至違規(guī)添加，導致了耐藥性問題和肉中抗生素殘留超標問題?？股卦谙麥绮【耐瑫r，也消滅了對動物機體有益生理性細菌，破壞腸道微生態(tài)平衡，使動物機體產(chǎn)生了抗藥性細菌，危害食用者身體健康[4]。2015年9月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告，禁止在食用動物中使用如洛美沙星等4 種抗生素，2020年飼料將全面禁抗。因此，無抗養(yǎng)殖將是大勢所趨。

在眾多替代抗生素的治療方案中，益生菌療法是有效治療腸道疾病的重要方案之一。研究表明[5]，腸道微生物菌群分布情況可影響個體健康狀況，腸道內(nèi)的益生菌可以創(chuàng)造極端環(huán)境或者分泌相關(guān)因子掌控有害菌的存活繁衍。選用無耐藥性的益生菌不會帶來化學污染，或者腸胃腎臟肝臟損傷，也不會堆積在體內(nèi)造成殘留，故而使用益生菌治療結(jié)腸炎具有巨大現(xiàn)實意義，本研究采用多種混合菌種制成EM 菌劑來改善治療結(jié)腸炎。本研究選用這6 種微生物及其原因：地衣芽胞桿菌是需氧型益生菌，使用后可以讓其進入腸道中搶奪氧氣以此來制造無菌環(huán)境，促進腸道內(nèi)其他正常厭氧菌的生存而且可以抑制有害細菌的繁殖[6]；凝結(jié)芽孢桿菌主要生存空間位于結(jié)腸和盲腸中，服用后會在結(jié)腸和盲腸中生存與大量繁殖，且隨其生長會產(chǎn)生大量于機體有益的和可以抗菌的小分子物質(zhì)[7]；德氏乳桿菌保加利亞亞種與釀酒酵母可分別大量產(chǎn)生乳酸和二氧化碳；屎腸球菌可以抑制腸道菌群菌氨的產(chǎn)生，降低腸道內(nèi)pH，使有害菌無法生存；丁酸梭菌具有高效的調(diào)理腸道的作用，可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物菌落平衡，促進腸道內(nèi)益生菌群增殖[8]，減少毒性分子胺類和硫化氫等的產(chǎn)生，從而降低各種疾病的發(fā)生[9]。為了研究上述組合的EM 菌在動物腸道疾病修復中的作用，本研究以小鼠腸道為模型，采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導小鼠腸道發(fā)生病變，并用EM 菌修復小鼠腸道，檢測小鼠體重、免疫酶活力、肛門便血情況以及腸道結(jié)構(gòu)變化，從而探索EM 菌對小鼠腸道病變的修復作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）試驗動物：昆明小鼠。

2）藥物與試劑：EM 菌劑、多聚甲醛粉末、液體石蠟、堿性磷酸酶（AKP）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）試劑盒、葡聚糖硫酸鈉（DSS）。

3）儀器：高速冷凍離心機、電動切片機、分光光度計、恒溫水浴鍋、蠟箱、液氮罐、-80 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

1）DSS 濃度的確定[10]。本試驗目的在于檢測EM菌劑中6 種菌是否對患有結(jié)腸炎的小鼠有緩解治療作用，故首先需要得到小鼠的腸道病變模型。選取12 只昆明小鼠（體重（30±3）g），分為3 組，每組4只，分別用3%、4%、5%的葡聚硫酸鈉混水代替清水喂食3 組小鼠，每天早上08:00 給藥，期間不給清水，其他喂養(yǎng)條件正常，每天觀察小鼠精神狀態(tài)及體重變化，7 d 后解剖觀察腸道形態(tài)。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇合適的DSS 濃度，建立小鼠腸道病變模型。

2）EM 菌修復小鼠腸道病變。根據(jù)上述試驗結(jié)果，選擇合適濃度的DSS 為小鼠給藥，且根據(jù)試驗目的設(shè)計試驗如下：將24 只昆明小鼠（30±3）g 分為3 組，每組8 只，分別為正常組、EM 菌組、自然恢復組，將3 組小鼠在同樣室溫下飼養(yǎng)。將EM 菌組、自然恢復組小鼠每天17:00 給予DSS 混水飲服，給藥飲服7 d，待其發(fā)?。徽＝M小鼠每天17:00 給予正常清水。EM 菌組小鼠發(fā)病后開始給EM 菌治療，每天17:00 飲服5 mL EM 菌液，設(shè)恢復期為7 d，觀察恢復期內(nèi)小鼠生理形態(tài)變化。將自然恢復組小鼠發(fā)病后不給予藥物治療，讓其根據(jù)自身免疫力自然恢復，觀測其與EM 菌組小鼠的生理變化差別。且試驗在第7 天、第14 天用摘眼球取血法分別各自采集正常組、EM 菌組、自然恢復組小鼠的血液，靜置凝固后，低溫離心，取上層血清待測，解剖取出肝臟液氮封存待測，將血清、肝臟分別按照試劑盒給定說明書方法用分光光度計測小鼠堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）的酶活性。取出結(jié)腸處理包埋，于切片機上制8 μm 石蠟橫切切片[11]，并且在試驗期間每天觀察和記錄小鼠的各種身體狀況變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSS 濃度對小鼠腸道病變的影響

分別采用不同濃度的DSS 喂食小鼠，結(jié)果顯示（圖1），采用3%的DSS 喂食小鼠，解剖后觀察發(fā)現(xiàn)腸道出現(xiàn)變化，腸道內(nèi)壁微微發(fā)炎，但無明顯血便，毛色暗淡，無明顯怕冷發(fā)抖癥狀，且停藥后很快恢復正常，故3% DSS 濃度不符合試驗需要，排除3%DSS 濃度攻毒；4% DSS 濃度的小鼠攻毒4 d 后出現(xiàn)血便，毛色暗淡，小鼠行動不再活躍，且不停發(fā)抖，單個小鼠時喜歡往木屑里藏，有明顯怕冷現(xiàn)象，飲水飲食量明顯下降，7 d 后解剖發(fā)現(xiàn)腸道有明顯發(fā)炎現(xiàn)象；5%持續(xù)1 周后全部死亡，判斷5%濃度過大，排除5%的濃度，故根據(jù)預試驗結(jié)果決定正式試驗選用4%的DSS 來攻毒昆明小鼠，建造小鼠結(jié)腸炎模型。

2.2 小鼠體重及肛門便血情況變化

圖1 DSS 濃度對小鼠腸道形態(tài)的影響

各組小鼠體重及肛門便血情況如圖2 和圖3所示，可知正常組的小鼠體重在飼養(yǎng)期間不停地上升，而給DSS 組的小鼠前3 d 體重變化不明顯，3 d后體重開始大幅下降，并且肛門較正常小鼠顏色深，從淺粉色變?yōu)樯罴t色，糞便顏色也稍有變化，較之前糞便顏色變深發(fā)黑。隨給DSS 時間延長，個別小鼠便血愈發(fā)嚴重，出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象，且小鼠精神萎靡不振。7 d 后未給EM 菌的自然恢復組小鼠便血越發(fā)嚴重，且在停止給DSS 后的4 d 內(nèi)全部死亡；而給EM 菌的試驗組小鼠有部分便血過于嚴重的在給EM 菌第2 天就已經(jīng)死亡，其余小鼠在給EM 菌的前2 d 體重持續(xù)下降或維持不變，后期體重略有回升，第10 天開始部分小鼠停止血便，但其中2 只在給EM 菌的第5 天和第6 天相繼死亡，死亡時已停止血便。

圖2 試驗過程中小鼠體重的變化

2.3 小鼠免疫酶活力變化

根據(jù)圖4 可知血清堿性磷酸酶、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在給DSS 期間均在不斷上升，但給EM 菌后血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清堿性磷酸酶、肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶都開始以不同幅度下降。有研究表明[12-14]，堿性磷酸酶可以緩解小鼠腸道病變，故在給DSS 誘導小鼠患病時，由于小鼠自身免疫力促進小鼠分泌合成堿性磷酸酶，所以測得的小鼠堿性磷酸酶活性不斷升高，后期由于給予EM 菌緩解治療小鼠的腸道病變，所以小鼠體內(nèi)的堿性磷酸酶活性下調(diào)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶多分泌于肝臟受損時[15]，隨著給DSS 時間增長，小鼠的肝臟也受到了一定損傷，肝臟細胞通透性增加，從肝臟滲透到血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶增多，后期隨著小鼠逐漸恢復，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性下降，但并未恢復到正常水平，同時解剖后的小鼠肝臟也證明了肝臟有受傷后恢復現(xiàn)象，從圖5中可以看到由于肝界板破壞，炎細胞浸潤，纖維組織增生包繞壞死組織形成的局限性壞死，呈白色顆粒狀[16]。

圖3 試驗過程中小鼠肛門及糞便變化

圖4 小鼠酶活力變化

圖5 小鼠肝臟變化

2.4 小鼠腸切片觀察

從圖6 中可以明顯看出，經(jīng)由DSS 攻毒后的腸道損傷嚴重，腸道上的絨毛幾乎消失，且腸壁變薄，而給EM 菌恢復后的腸道開始好轉(zhuǎn)，腸壁明顯變厚，且有部分腸道絨毛重新出現(xiàn)，由此可見EM 菌對于結(jié)腸炎的恢復具有一定作用。

3 結(jié)論

4%的DSS 連續(xù)喂食小鼠可以很好地建立腸道病變模型，小鼠在停藥后病情依然持續(xù)加重，很快出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。而在腸道發(fā)生病變后，及時喂食EM菌，小鼠的體重逐步恢復、免疫酶活力幾乎恢復正常、腸道內(nèi)壁結(jié)構(gòu)也與正常小鼠相似，小鼠死亡率大大降低。因此，EM 菌在腸道病變的修復方面具有顯著作用，該結(jié)果為EM 菌在動物腸道疾病治療方面的應用提供了重要依據(jù)。

圖6 小鼠腸切片