馬鑫文，王程，張瑞春，屈玉疆，劉俊昌

慢傳輸型便秘(slow transit constipation, STC)是由于大腸功能紊亂、傳導(dǎo)失常而導(dǎo)致的排便周期延長和排便困難。其發(fā)病機(jī)制可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)及自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能障礙、激素水平異常等多種因素有關(guān)[1-6]。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT) 是參與調(diào)節(jié)胃腸道分泌和運(yùn)動功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)和旁分泌信號分子。其中 5-HT3受體(5-HT3R)、5-HT4受體(5-HT4R)與胃腸道動力存在緊密聯(lián)系。莫沙必利是目前臨床上常使用的 5-HT4受體激動劑之一，常被用來調(diào)節(jié)胃腸道動力，促進(jìn)腸道蠕動。腹部推拿是中醫(yī)特色療法之一，近年研究表明，腹部推拿能夠明顯改善慢傳輸型便秘的臨床癥狀，緩解患者的疾病狀態(tài)[3-6]，但其作用機(jī)制目前尚未明確?，F(xiàn)通過研究腹部推拿聯(lián)合5-HT4受體激動劑對STC大鼠進(jìn)行治療并觀察療效，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性SD大鼠65只， SPF級，6周齡，體質(zhì)量(180±20)g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，自由進(jìn)食、飲水飼養(yǎng)于實驗動物房。(2)試藥試劑：SCF、c-kit和GAPDH抗體均購自Proteintech公司，RNA提取試劑盒購自Promega公司，RIPA蛋白裂解液、P物質(zhì)(SP)、一氧化氮(NO)、5-HT及血管活性腸肽(VIP)檢測ELISA 試劑盒購自上海碧云天公司，ECL顯色液購自Thermo公司。(3)儀器設(shè)備：酶標(biāo)儀(MB-530)購自濟(jì)南好來寶醫(yī)療器材有限公司，雙垂直電泳儀(DYCZ-25D)、轉(zhuǎn)印電泳儀(DYCZ-40G)購自北京六一儀器有限公司，凝膠成像儀(Gel Doc XR)購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，離心機(jī)(FC5718 230V)購自奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 STC大鼠模型的建立 2017年10月—2018年6月于新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院進(jìn)行實驗。65只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：對照組、模型組、推拿組、莫沙必利組、推拿聯(lián)合莫沙必利組(聯(lián)合組)，每組13只。除對照組外，其余各組大鼠采用腸神經(jīng)節(jié)消融術(shù)造模，大鼠麻醉后仰臥于手術(shù)臺上，無菌條件下取腹部正中切口，長約4 cm，充分暴露結(jié)腸，取寬度約1 cm雙層紗布，使用生理鹽水完全浸濕，包繞全部結(jié)腸，紗布長度與腸管相當(dāng)，保持紗布濕潤，每5 min沿紗布長軸間隔約1 cm各滴3滴0.25%苯扎氯銨溶液，其余器官用濕紗布覆蓋、隔離，共30 min，術(shù)后逐層關(guān)腹；對照組不做處理，相同條件下繼續(xù)喂養(yǎng)。所有大鼠術(shù)后12 h恢復(fù)正常飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，給予青霉素鈉1周，注意觀察大鼠排便、精神和營養(yǎng)狀況。為確保實驗結(jié)果可靠性和減少誤差，所有模型制備均由指定動物實驗員完成，且以糞粒干燥、粒形縮短、排便費(fèi)力、日排便量低于對照組大鼠作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后，對各組大鼠進(jìn)行稱重，記為初始體質(zhì)量，推拿組按照特定方法進(jìn)行腹部推拿。莫沙必利組大鼠予0.15 mg/ml莫沙必利10 ml/kg灌胃，聯(lián)合組每天予推拿+0.15 mg/ml莫沙必利10 ml/kg灌胃，每日1次，連續(xù)給藥14 d。對照組及模型組只擺相同體位，不進(jìn)行腹部推拿。除莫沙必利組及聯(lián)合組，其余各組根據(jù)大鼠體質(zhì)量予生理鹽水10 ml/kg灌胃，每日1次，連續(xù)給予14 d。

1.3 腹部推拿方法 根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]方法，選用腹部推拿中核心手法“按法”“摩法”作為主要干預(yù)手法。為保證手法的一致性，實驗前應(yīng)用YF-3 手法測定儀采集操作手法信息，對手法的用力大小、頻率等進(jìn)行標(biāo)定，建立手法操作模型。實驗過程中由專人操作，手法操作者除掌握手法要點外，還需應(yīng)用 YF-3手法測定儀進(jìn)行評測，待其手法的力度大小、頻率形成的波形軌跡與手法模型基本一致后，方可用于實驗大鼠。取穴參考《實驗推拿學(xué)》[17]，選取大鼠的關(guān)元穴、中脘穴。腹部按法: 手法操作者以右手食指、中指二指疊按置于關(guān)元穴上，余指并攏。以右手腕關(guān)節(jié)為支點，食、中二指掌指部主動施力，向恥骨聯(lián)合脊柱方向徐徐按下，力量自輕至重，待指面感覺到大鼠腹部動脈輕微搏動，按而留之，完成此過程大約30 s，后維持此時的壓力及其所達(dá)到的深度，靜待 1 min 后掌指部徐徐上提，直至完全離開受壓部位，此過程大約持續(xù) 30 s。如此反復(fù)操作 2 次，共 4 min。腹部摩法: 手法操作者肘關(guān)節(jié)自然屈曲，腕部放松，指掌自然伸直，食指、中指并攏。以食指、中指指面著于施術(shù)部位，以腕關(guān)節(jié)為中心，連同掌、指作環(huán)形摩動，并以中脘穴為圓心，做順時針方向節(jié)律性環(huán)旋運(yùn)動，頻率宜緩，每分鐘20～30次，操作6 min，每天治療 1 次，連續(xù)治療 14 d。

1.4 觀測指標(biāo)與方法

1.4.1 體質(zhì)量、糞便含水率測定：實驗期間大鼠正常飲食，每日收集各組大鼠糞便，稱重后記為濕重，然后置于90℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥3 h至恒重，記為干重，并按照以下公式計算各組大鼠糞便含水率，糞便含水率=(濕重-干重)/濕重×100%；在最后一次推拿及給藥24 h后，再次對各組大鼠進(jìn)行稱重，記為最終體質(zhì)量，計算各組大鼠體質(zhì)量增加值(體質(zhì)量增加值=最終體質(zhì)量-初始體質(zhì)量)。

1.4.2 血漿SP、NO、5-HT及VIP水平測定： 采取大鼠眼眶后靜脈叢血2 ml至肝素潤洗過的離心管中，室溫靜置5 min，然后離心取上清液，按照 ELISA 試劑盒說明書檢測SP、NO、5-HT及VIP水平。

1.4.3 大鼠腸推動率測定：每組取6只大鼠，禁食不禁水24 h 后，每只大鼠予濃度為100 g/L的活性炭混懸液1 ml灌胃， 1 h后行烏拉坦腹腔注射麻醉，立即解剖，取出從幽門至直腸末端的全部腸道，測量腸道全長及幽門至黑色物質(zhì)前端的距離，計算腸推動率(%)=黑色物質(zhì)自幽門至腸道末前端的距離/腸道全長×100%。

1.4.4 大鼠結(jié)腸組織蛋白檢測：每組取6只大鼠，大鼠頸椎脫臼處死后迅速分離結(jié)腸組織，用生理鹽水清洗干凈腸道內(nèi)容物，用濾紙吸干表面水分后，取部分結(jié)腸組織用于實時定量PCR檢測，其余部分放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解， 4℃離心留取上清液，向其中加入SDS緩沖液，混勻后放入100℃水浴5 min，然后放入-20℃儲存?zhèn)溆?。將凍存的結(jié)腸組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取蛋白50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)SCF、c-kit及GAPDH抗體(1∶1 000)孵育后，4℃過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進(jìn)行灰度值檢測。

1.4.5 大鼠結(jié)腸組織RNA檢測：采用RNA提取試劑盒分別提取各組大鼠結(jié)腸組織的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，熒光實時定量PCR檢測各組大鼠結(jié)腸組織中β-actin、5-HT3R和5-HT4R mRNA的表達(dá)。各檢測基因的實時定量PCR引物見表1，實時定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。

表1 實時定量PCR檢測的基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量增加值比較 與對照組比較，模型組體質(zhì)量增加值較高(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯(lián)合組大鼠體質(zhì)量增加值均依次降低(P<0.05)，且與推拿組及莫沙必利組比較，聯(lián)合組STC大鼠體質(zhì)量增加值降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量增加值比較

2.2 各組大鼠糞便含水率比較 與對照組比較，模型組STC大鼠糞便含水率降低(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯(lián)合組大鼠糞便含水率依次升高(P<0.05)，且聯(lián)合組大鼠較推拿組及莫沙必利組均顯著升高(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠糞便含水率比較

2.3 各組大鼠血漿SP、NO、5-HT及VIP水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血漿SP水平降低(P<0.05)，NO、5-HT及VIP水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯(lián)合組大鼠血漿SP水平均升高(P<0.05)，NO、5-HT及VIP水平均降低(P<0.05)；同時，聯(lián)合組較推拿組及莫沙必利組升高/降低顯著(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠血漿SP、NO、5-HT及VIP水平比較

2.4 各組大鼠腸推動率比較 與對照組比較，模型組大鼠腸推動率顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯(lián)合組大鼠腸推動率均顯著升高(P<0.05)，同時，聯(lián)合組大鼠腸推動率較推拿組及莫沙必利組顯著升高(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 各組大鼠腸推動率比較

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R及5-HT4R mRNA表達(dá)比較 與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織5-HT3R及5-HT4R mRNA水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯(lián)合組大鼠結(jié)腸組織5-HT3R及5-HT4R mRNA水平均顯著升高(P<0.05)，同時，聯(lián)合組較推拿組及莫沙必利組顯著升高(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R及5-HT4R mRNA表達(dá)比較

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織SCF、c-kit蛋白水平比較 與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織SCF、c-kit水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯(lián)合組均升高(P<0.05)，且聯(lián)合組較推拿組及莫沙必利組升高(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與推拿組比較，cP<0.05；與莫沙必利組比較，dP<0.05

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織SCF、c-kit蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

STC是由于大腸功能紊亂，傳導(dǎo)失常而導(dǎo)致的排便周期延長和排便困難。臨床以大便干結(jié)、排便次數(shù)減少、排便費(fèi)力伴腹脹等為主要癥狀。目前，STC 的發(fā)病機(jī)制尚不能完全明確，其發(fā)病機(jī)制可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)及cajal間質(zhì)細(xì)胞、中樞神經(jīng)及自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能障礙、激素水平異常等有關(guān)[1-3]。此外，長期不良的生活習(xí)慣，如起居無規(guī)律、飲食過于精細(xì)、減肥、節(jié)食及缺少運(yùn)動等，均可使腸道受刺激不足，排便動力缺乏，糞便在腸腔內(nèi)滯留時間過久而形成慢傳輸型便秘[4-8]。

5-HT是參與調(diào)節(jié)胃腸道分泌和運(yùn)動功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)和旁分泌信號分子。研究發(fā)現(xiàn)，5-HT 參與腹瀉、便秘型腸易激綜合征及慢傳輸型便秘的病理生理過程，5-HT3受體(5-HT3R) 、5-HT4受體(5-HT4R)與胃腸道動力存在緊密聯(lián)系，其分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)異常都能引起胃腸道疾病，此外，5-HT4受體激動劑可以增強(qiáng)小鼠結(jié)腸運(yùn)動功能，增強(qiáng)腸道的傳輸功能[9-12]。莫沙必利作為臨床常用的5-HT4受體激動劑之一，其能夠促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮和蠕動，同時具有增加近端結(jié)腸傳輸?shù)墓δ躘13-16]。現(xiàn)代研究顯示，腸神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)是導(dǎo)致功能性便秘的主要病理變化之一，5-HT、NO、SP、VIP是調(diào)節(jié)腸道功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，可對腸道運(yùn)動發(fā)揮興奮或抑制作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為便秘多由飲食不節(jié)、情志失調(diào)等因素所致，其病位在大腸，與肺、脾、腎、肝相關(guān)。腹部推拿是中醫(yī)特色療法之一[15]。穴位主要指人體經(jīng)絡(luò)線上特殊的點區(qū)部位，中醫(yī)可以通過針灸或者推拿、點按、艾灸刺激相應(yīng)的經(jīng)絡(luò)點治療疾病。通過推拿按摩腹部穴位，可直接作用于胃腸，加速腸蠕動，減少腸道對糞便水分的吸收，同時也增強(qiáng)腹肌力量，從而有利于便秘的改善[17-20]。

腹部推拿是中醫(yī)學(xué)治療胸腹部疾病的一種常見治療手段，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，使用促進(jìn)胃腸道蠕動的藥物能夠治療胃腸道蠕動功能異常疾病，而中醫(yī)推拿學(xué)認(rèn)為，通過相應(yīng)按摩手法能夠達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、推行氣血、扶傷止痛、祛邪扶正、調(diào)和陰陽的目的，兩者概念雖不同，其本質(zhì)相同，腹部推拿也間接借助外力促進(jìn)了胃腸道的蠕動[21]。本研究首次通過大鼠腸神經(jīng)節(jié)消融術(shù)建立STC大鼠模型，對STC大鼠進(jìn)行連續(xù)14 d的腹部推拿聯(lián)合5-HT4受體激動劑莫沙必利干預(yù)后，觀察其對大鼠體內(nèi)SCF/c-kit信號通路的影響及STC大鼠體內(nèi)相關(guān)指標(biāo)的變化和疾病轉(zhuǎn)歸情況。結(jié)果表明，與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯(lián)合組STC大鼠糞便含水率顯著增加，血漿SP水平顯著升高，NO、5-HT及VIP水平均顯著降低，結(jié)腸組織中5-HT3R及5-HT4R mRNA水平、SCF、c-kit水平均顯著升高，且聯(lián)合組大鼠各項指標(biāo)轉(zhuǎn)歸效果均顯著優(yōu)于推拿組及莫沙必利組，提示腹部推拿聯(lián)合5-HT4受體激動劑能協(xié)同促進(jìn)胃腸道蠕動，進(jìn)而強(qiáng)效改善STC大鼠癥狀，促進(jìn)疾病轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，腹部推拿聯(lián)合5-HT4受體激動劑能夠調(diào)節(jié)STC大鼠體內(nèi)SCF/c-kit信號通路，緩解STC大鼠疾病狀態(tài)，改善其疾病轉(zhuǎn)歸。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

馬鑫文：提出研究思路、研究選題；王程：設(shè)計研究方案、研究流程；張瑞春：實施研究過程，數(shù)據(jù)收集；屈玉疆：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理，數(shù)據(jù)分析；劉俊昌：修訂論文、論文終審