劉陽(yáng)，鄭小龍，喻志源，王偉，謝敏杰

血管新生在腦缺血后神經(jīng)修復(fù)中具有重要作用。腦缺血時(shí)血流中斷引起氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給障礙，細(xì)胞能量代謝紊亂，離子穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞凋亡。腦缺血后新生血管的形成增加了缺血區(qū)血流供應(yīng)，促進(jìn)了新生血管網(wǎng)絡(luò)的形成，為缺血缺氧組織提供能量，促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)[1]。細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)表氧化酶可代謝花生四烯酸而生成一種小分子活性物質(zhì)—環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)。根據(jù)環(huán)氧基位置的不同，EETs分為4種亞型: 5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET。研究報(bào)道，EETs主要由CYP表氧化酶家族中CYP2C和CYP2J 2種亞型代謝花生四烯酸而生成。EETs在體內(nèi)被表氧化物水解酶(soluble epoxidehydrolase, sEH)代謝生成沒有活性或活性很低的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids, DHET)從而構(gòu)成一個(gè)完整的系統(tǒng)發(fā)揮生理作用。既往研究報(bào)道，EET具有非常廣泛的生物學(xué)功能，包括擴(kuò)張血管，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，細(xì)胞遷移及抗炎等[2]。然而，腦缺血后CYP-EET信號(hào)系統(tǒng)對(duì)梗死邊緣區(qū)血管新生的影響及其相關(guān)機(jī)制目前尚不清楚。本研究采用外源性14,15-EET或sEH選擇性抑制劑12-(3-金剛烷-1-基-脲基)十二烷酸[12-(3-adamantan-1-yl-ureido)dodecanoic acid，AUDA]增加內(nèi)源性EETs的含量，研究CYP-EETs信號(hào)系統(tǒng)對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)缺血再灌注后血管新生及相關(guān)信號(hào)通路的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物：SPF 級(jí)健康成年SD 雄性大鼠80 只，體質(zhì)量220～250 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定，并獲得華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意；(2)試藥試劑：p-Erk兔多克隆抗體、p-Akt兔多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司)，GAPDH鼠單克隆抗體(購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司),vWF兔多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司),VEGF鼠單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司),VEGFR兔多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司), cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG(購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司)，IRDye 800-conjugated山羊抗兔IgG，Alexa Fluor700-conjugated 山羊抗小鼠IgG(購(gòu)自美國(guó)LI-COR Biosciences公司)，RIPA強(qiáng)蛋白裂解液(購(gòu)自美國(guó)Pierce公司)，BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Thermo公司)，蛋白酶抑制劑cocktail，磷酸化蛋白酶抑制劑(購(gòu)自美國(guó)Roche公司)，蛋白Marker(1811)(購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司)，凝膠配置試劑盒(購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司)，NC膜(購(gòu)自美國(guó)Millipore公司)，14,15-DHET ELISA試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Detroit R&D公司)；(3)儀器設(shè)備：Alzet給藥微泵2001型、Alzet Brain Infusion Kits 2(購(gòu)自美國(guó) Durect公司)，SR-6N 立體定位儀(購(gòu)自日本Narishige 公司)，CM1900 冰凍切片機(jī)(購(gòu)自德國(guó)Leica 公司)，Odyssey IR成像系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)LI-COR Biosciences公司)，激光共聚焦顯微鏡(購(gòu)自日本Olympus公司)。

1.2 動(dòng)物分組及造模 2017年6月—2018年4月于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 動(dòng)物分組：研究分為2部分。(1)研究大鼠MCAO后不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)14,15-EET的變化，大鼠分為假手術(shù)組和缺血(MCAO)組，分別于缺血再灌注后1 d、3 d、7 d檢測(cè)各組大鼠腦組織14,15-EET；(2)研究CYP-EET信號(hào)系統(tǒng)對(duì)大鼠MCAO缺血再灌注后血管新生、VEGF/VEGFR、Erk、Akt信號(hào)通路的影響，大鼠分為假手術(shù)組、溶劑對(duì)照組、14,15-EET干預(yù)組、AUDA干預(yù)組，分別于缺血再灌注后1 d、3 d、7 d進(jìn)行檢測(cè)，其中1 d、3 d檢測(cè)VEGF、p-Erk、p-Akt蛋白水平；7 d檢測(cè)vWF、VEGFR陽(yáng)性的微血管密度。

1.2.2 動(dòng)物造模：以參考文獻(xiàn)[3]的方法建立大鼠MCAO模型。采用右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓的方法阻斷同側(cè)大腦中動(dòng)脈血流，首先腹腔注射氯胺酮和異丙嗪復(fù)合麻醉大鼠，采用仰臥位并固定，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈；結(jié)扎頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈近心端，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈；在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用顯微剪做一切口，將線栓由此切口緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至線栓頭部到達(dá)右側(cè)大腦中動(dòng)脈處；激光多普勒血流監(jiān)測(cè)可見血流下降值約為基線水平的 70%～80%即造模成功[4]；缺血1 h后緩慢拔出線栓實(shí)施缺血后再灌注。假手術(shù)組不插入線栓，其余操作與上述一致。手術(shù)期間，利用保溫墊使直腸溫維持在(37.0±0.5)℃。干預(yù)組缺血前30 min采用Alzet給藥微泵持續(xù)側(cè)腦室給藥，藥物濃度為14,15-EET 10 μmol/L，AUDA 1 mmol/L，溶劑對(duì)照組注射含有相同濃度二甲基亞砜(DMSO)的生理鹽水，給藥劑量參照文獻(xiàn)[5]，給藥時(shí)間為7 d,Alzet給藥微泵的使用嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 14,15-EET檢測(cè)：采用14,15-DHET ELISA競(jìng)爭(zhēng)性試劑盒檢測(cè)大鼠MCAO缺血再灌注后1、3、7 d腦組織勻漿中14,15-DHET含量,最終換算為腦組織14,15-EET的水平。測(cè)定嚴(yán)格按照儀器和試劑盒要求進(jìn)行。

1.3.2 vWF及VEGFR陽(yáng)性的微血管密度檢測(cè)：采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)。大鼠深度麻醉后斷頭取腦，-80℃異戊烷速凍，-20 ℃冰凍切片機(jī)切片，厚度為10 μm，貼于多聚賴氨酸包被的玻片上。4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定15 min，0.01 mol/L PBS 漂洗后0.25%Triton-X100 破膜，10%BSA 室溫封閉2 h，加入一抗vWF(1∶400)、 VEGFR(1∶100)4℃孵育過夜。陰性對(duì)照采用抗體稀釋液孵育過夜，0.01 mol/L PBS漂洗后避光加入二抗cy3 標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶400)，室溫孵育1 h。Olympus激光共聚焦顯微鏡采集圖像。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，同一曝光參數(shù)下采集圖像，Image-J軟件統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)視野下vWF及VEGFR陽(yáng)性的微血管密度。

1.3.3 腦組織蛋白濃度檢測(cè)： 采用Western-bolt法測(cè)量。大鼠深度麻醉后斷頭取腦，取缺血邊緣區(qū)大腦皮質(zhì)，RIPA 裂解液提取總蛋白，離心取上清，蛋白變性后制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠并加樣電泳，將蛋白轉(zhuǎn)膜至0.45 μm 醋酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，p-Erk兔多克隆抗體(1∶500)、p-Akt兔多克隆抗體(1∶500),VEGF 鼠單克隆抗體(1∶500)，GAPDH 鼠單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，0.5% TBST 漂洗(6 min×4 次)，IRDye 800-conjugated 羊抗兔二抗(1∶5 000), Alexa Fluor700-conjugated山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)室溫避光孵育1 h；用Odyssey IR紅外顯像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的免疫活性，記錄平均吸光度(mean optical density)，并以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行校正。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠MCAO后不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)14,15-EET的變化 大鼠MCAO缺血再灌注后1、3、7 d腦組織勻漿中總的14,15-EET比較，第1 d缺血組低于假手術(shù)組(P<0.05)；第3、7 d缺血組均高于假手術(shù)組(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠MCAO后不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)14,15-EET水平比較

2.2 各組腦組織vWF及VEGFR陽(yáng)性的微血管密度比較 采用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物vWF標(biāo)記微血管內(nèi)皮細(xì)胞, 第7天，溶劑對(duì)照組明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，14，15-EET干預(yù)組、AUDA干預(yù)組明顯高于溶劑對(duì)照組(P<0.05)。

采用VEGFR標(biāo)記新生血管，第7天，溶劑對(duì)照組明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，14，15-EET干預(yù)組明顯高于溶劑對(duì)照組(P<0.05)；AUDA干預(yù)組雖然較溶劑對(duì)照組增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、表2。

表2 干預(yù)后vWF和VEGFR陽(yáng)性微血管密度比較

2.3 各組腦組織VEGF蛋白表達(dá)比較 采用Western-bolt方法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)，第1天及第3天時(shí)，溶劑對(duì)照組明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，14，15-EET干預(yù)組、AUDA干預(yù)組明顯高于溶劑對(duì)照組(P<0.05)，見圖2、表3。

表3 各組干預(yù)后VEGF蛋白表達(dá)水平比較

注：與假手術(shù)組比較，aP< 0.05；與溶劑對(duì)照組比較，bP< 0.05

2.4 各組腦組織干預(yù)后p-Akt和p-Erk蛋白表達(dá)比較 Western-bolt結(jié)果顯示，第3天時(shí)，溶劑對(duì)照組p-Akt及p-Erk蛋白水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，14，15-EET干預(yù)組、AUDA干預(yù)組明顯低于溶劑對(duì)照組(P<0.05)，見圖3、表4。

表4 各組干預(yù)后p-Akt和p-Erk蛋白表達(dá)水平比較

注：A.紅色熒光代表血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF，標(biāo)尺=100 μm;B.紅色熒光代表VEGFR陽(yáng)性新生血管，標(biāo)尺=50 μm

圖1 各組vWF及VEGFR陽(yáng)性的微血管密度比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與溶劑對(duì)照組比較,bP<0.05

圖3 各組干預(yù)后p-Akt、p-Erk蛋白表達(dá)比較

3 討 論

CYP表氧化酶-EETs信號(hào)系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都具有重要的作用。生理情況下，EETs被認(rèn)為是突觸傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，參與腦血流的調(diào)節(jié)、皮質(zhì)血管新生、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)激素的生成等[6]。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠全腦缺血模型中，腦組織及血漿中14,15-DHET水平較對(duì)照組顯著升高，過表達(dá)CYP2J2小鼠腦缺血后梗死體積、細(xì)胞凋亡較野生型小鼠顯著減少，說明EETs在腦缺血過程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，MCAO后3、7 d時(shí)腦內(nèi)14,15-EET含量顯著升高，但是1 d時(shí)14,15-EET含量卻減少，推測(cè)該變化可能的原因是腦缺血急性期大量細(xì)胞壞死，導(dǎo)致EETs生成減少，而后期膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化，血管內(nèi)皮細(xì)胞新生后EETs的生成代償增多。

研究發(fā)現(xiàn)，EETs發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制主要與抗凋亡、抗炎性反應(yīng)、抗血栓形成等有關(guān)。Geng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，EETs通過抑制Caspase-3的激活、細(xì)胞色素C釋放發(fā)揮抗凋亡作用，減少梗死體積。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)EETs通過減少缺血后炎性因子TNF-α、IL-6、NF-κB、iNOS分泌，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)EETs在腫瘤、心肌梗死、視網(wǎng)膜等疾病中具有促進(jìn)血管新生的作用[10-11]，然而EETs信號(hào)系統(tǒng)在腦缺血中是否具有促進(jìn)血管新生的作用尚不清楚。故本研究建立MCAO缺血再灌注模型，分別通過側(cè)腦室注射外源性14,15-EET和AUDA增加內(nèi)源性EETs，觀察其對(duì)血管新生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源性加入14，15-EET或sEH抑制劑AUDA可顯著增加缺血邊緣區(qū)微血管密度。VEGF參與腦缺血后一系列神經(jīng)損傷修復(fù)的過程，包括促進(jìn)神經(jīng)元存活、血管新生、神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、遷移和分化[12-13]。 VEGFR-2作為VEGF的重要受體表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元，VEGF/VEGFR信號(hào)通路在血管新生及神經(jīng)損傷與修復(fù)中扮演了重要角色[14]。Sommer等[15]研究發(fā)現(xiàn)，EETs可顯著增加VEGF表達(dá)，促進(jìn)缺血誘導(dǎo)的創(chuàng)傷處血管新生；Zhao等[16]報(bào)道，EETs增加心肌梗死后VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管新生。此外，Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，sEH抑制劑可促進(jìn)缺氧缺糖時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF，激活神經(jīng)元VEGFR，減少神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明，有絲分裂原活化蛋白激酶(Erk)及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)磷酸化等機(jī)制可能是VEGF/VEGFR的下游通路[18-20]。與此類似，本研究發(fā)現(xiàn)外源性加入14，15-EET或sEH抑制劑AUDA可顯著上調(diào)缺血邊緣區(qū)VEGF和VEGFR的表達(dá)，同時(shí)抑制Erk和Akt的蛋白磷酸化水平，說明EET的血管新生作用與上調(diào)VEGF/VEGFR的表達(dá)密切相關(guān)，Erk及Akt信號(hào)通路可能是其重要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究在MCAO缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，CYP-EET信號(hào)系統(tǒng)可以增加缺血邊緣區(qū)微血管密度，可能與VEGF/VEGFR信號(hào)通路激活有關(guān)。后期尚需要更多體外細(xì)胞水平的信號(hào)通路研究加以證實(shí)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉陽(yáng)：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；鄭小龍：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核; 喻志源、王偉、謝敏杰：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改