周莉蓉,王琪,麥碧薇,朱乃云,雷智賢
急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床常見的一種危急重癥,其臨床表現(xiàn)主要為難治性低氧血癥和進行性呼吸困難,進而出現(xiàn)呼吸衰竭,因而病死率較高,對患兒的生命構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[1-2]。引起ARDS的病因錯綜復(fù)雜,至今還未完全闡明,研究認(rèn)為ARDS的病理生理學(xué)機制與炎性因子失衡密切相關(guān),炎性因子是ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的核心環(huán)節(jié)[3]。另有研究報道,血清炎性因子水平與兒童ARDS的發(fā)生發(fā)展及疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4]。近年來大量研究顯示,microRNA(miRNA)參與了炎性反應(yīng)的調(diào)控過程,其機制主要是通過與靶基因mRNA 的3’端非編碼區(qū)域結(jié)合,引起靶基因mRNA的降解或抑制轉(zhuǎn)錄翻譯過程,調(diào)控基因的表達(dá)[5]。有報道稱miR-21在急性肺損傷的小鼠模型中表達(dá)上調(diào),與炎性因子的表達(dá)密切相關(guān),并且在呼吸窘迫綜合征早產(chǎn)兒血清中的表達(dá)水平也明顯升高[6-7]。然而miR-21在兒童ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的作用還不清楚,是否參與調(diào)控了兒童ARDS的炎性水平也未見相關(guān)報道。因此,現(xiàn)分析ARDS患兒血清miR-21水平與疾病嚴(yán)重程度和炎性因子水平的關(guān)系,并探討miR-21在ARDS患兒中的作用機制,報道如下。
1.1 臨床資料 選取2016年3月—2019年2月海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心兒童重癥醫(yī)學(xué)科收治的ARDS患兒98例(ARDS組)作為研究對象,男48例,女50例;年齡1個月~10.5歲,平均年齡(3.6±2.4)歲。按照ARDS柏林定義[8]將ARDS患兒病情嚴(yán)重程度分為3個亞組,輕度亞組32例,男15例,女17例,年齡1個月~9.3歲,平均年齡(3.8±2.1)歲;原發(fā)?。悍尾扛腥?9例,支氣管異物1例,其他2例。中度亞組36例,男19例,女17例,年齡4個月~10.5歲,平均年齡(3.4±2.8)歲;原發(fā)病:肺部感染33例,支氣管異物2例,其他1例。重度亞組30例,男14例,女16例,年齡2個月~10.3歲,平均年齡(3.6±2.3)歲;原發(fā)?。悍尾扛腥?7例,支氣管異物1例,其他2例。3亞組患兒的性別、年齡和原發(fā)病比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。同期于本院健康體檢的兒童90例為對照組,男44例,女46例,年齡2個月~10.3歲,平均年齡(3.8±2.6)歲;近1個月內(nèi)無感染性疾病,未使用免疫抑制劑。ARDS組和對照組兒童性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn),受試者家屬知情同意并簽署知情同意書。
1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合國際兒童ARDS診斷共識標(biāo)準(zhǔn)[9];②患兒處于急性期(發(fā)病時間<3 d)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①由心力衰竭導(dǎo)致的呼吸衰竭;②其他原因?qū)е碌暮粑ソ摺?/p>
1.3 觀測指標(biāo)與方法
1.3.1 血清miR-21水平檢測: 收集ARDS患兒入院和健康體檢兒童體檢時的外周血各3 ml,使用Life Technologies公司的血清RNA提取試劑盒提取總RNA,測量RNA的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄,將逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA作為模型進行實時定量PCR, 反應(yīng)體系(10 μl):cDNA 0.2 μl,F(xiàn)orward primer (10 μmol/L) 0.5 μl,Reverse primer (10 μmol/L) 0.5 μl,ROX Ⅱ (50x) 0.2 μl,SYBR (2x)5 μl,RNase free water 3.6 μl,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min,重復(fù)40個循環(huán)。引物由上海生工有限公司合成,引物序列見表1。
表1 實時定量PCR擴增引物序列
1.3.2 血清炎性因子水平檢測:分別收集ARDS患兒入院和健康體檢兒童體檢時的外周血3 ml,離心獲得血清。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-17。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自上海碧云天生物公司,由實驗室專業(yè)人員進行操作。
2.1 2組血清miR-21和炎性因子水平比較 與對照組比較,ARDS組患兒血清miR-21、TNF-α、IL-6和IL-17水平均升高(P<0.01),見表2。
2.2 不同嚴(yán)重程度亞組間血清miR-21和炎性因子水平比較 血清miR-21、TNF-α、IL-6和IL-17水平隨著病情程度加重而升高,重度亞組>中度亞組>輕度亞組(P均<0.01),見表3。
2.3 不同預(yù)后患兒血清miR-21和炎性因子水平比較 ARDS患兒28 d內(nèi)病死39例,存活59例。死亡亞組患兒血清miR-21、TNF-α、IL-6和IL-17水平高于存活亞組(P<0.01),見表4。
2.4 血清miR-21水平與炎性因子的相關(guān)性 血清miR-21表達(dá)水平與血清炎性因子TNF-α、IL-6和IL-17水平均呈正相關(guān)(r=0.501、0.462、0.495,P均=0.000)。
2.5 血清miR-21水平預(yù)測ARDS患兒預(yù)后的價值 血清miR-21曲線下面積為0.796(95%CI0.729~0.862),最佳臨界值為1.54,敏感度和特異度分別為78.57%和82.65%,Youden指數(shù)為0.612,見圖1。
ARDS是以頑固性低氧血癥和進行性呼吸困難為特征的呼吸衰竭[10-11]。兒童ARDS的病死率較高,但臨床上仍缺乏比較可靠的疾病嚴(yán)重程度評估和預(yù)后判斷的指標(biāo)[12],因此尋找能夠評估兒童ARDS疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后判斷的指標(biāo)具有重要的臨床意義。炎性反應(yīng)是ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的核心環(huán)節(jié),在ARDS早期,肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)的炎性細(xì)胞釋放大量的炎性因子,如TNF-α和IL-6,從而加重了炎性反應(yīng)過程,誘導(dǎo)肺組織損傷[13]。IL-17也是炎性反應(yīng)過程中重要的炎性因子,其過度表達(dá)可以對組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷[14],研究也顯示,IL-17也參與了肺部的炎性反應(yīng)[15]。本研究證實血清TNF-α、IL-6和IL-17水平在ARDS患兒中升高,并且隨著ARDS病情的加重而升高,與劉靈芝[16]和Mikacenic等[17]的研究結(jié)果一致,說明TNF-α、IL-6和IL-17可以通過激活炎性反應(yīng)造成肺損傷,進一步導(dǎo)致ARDS患兒病情的加重。
圖1 miR-21預(yù)測ARDS患兒預(yù)后的ROC曲線
表2 2組受試者血清miR-21和炎性因子水平比較
表3 不同嚴(yán)重程度亞組血清miR-21和炎性因子水平比較
表4 不同預(yù)后患兒血清miR-21和炎性因子水平比較
研究顯示,miR-21在急性肺損傷的小鼠模型中表達(dá)上調(diào),并與炎性反應(yīng)密切相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn),ARDS患兒血清中miR-21的表達(dá)水平明顯高于健康兒童,并且隨著ARDS患兒病情的加重而升高,說明miR-21參與了ARDS的發(fā)生發(fā)展過程,并與ARDS疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。miRNA可以通過與靶基因mRNA 的3’端非編碼區(qū)域結(jié)合,引起靶基因mRNA的降解或抑制轉(zhuǎn)錄翻譯過程,調(diào)控炎性反應(yīng)基因的表達(dá),因此,本研究探討了血清miR-21表達(dá)水平與炎性因子水平的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)血清miR-21表達(dá)水平與TNF-α、IL-6和IL-17呈正相關(guān),說明miR-21可以調(diào)控TNF-α、IL-6和IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯過程,促使TNF-α、IL-6和IL-17表達(dá)增加,這些炎性因子可以通過血液循環(huán)或水腫液進入肺組織,從而激活肺組織的免疫反應(yīng),一方面可以募集大量炎性細(xì)胞,如嗜中性粒細(xì)胞,進入肺組織對抗病原體,另一方面這些炎性細(xì)胞在對抗病原體過程中過度表達(dá)的炎性介質(zhì)進一步對肺組織產(chǎn)生損傷,形成炎性反應(yīng)級聯(lián)瀑布放大效應(yīng),從而加重病情。提示血清miR-21表達(dá)水平可以作為判斷ARDS患兒病情嚴(yán)重程度的輔助指標(biāo)。其機制可能與二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(dimethylarginine dimethylaminohydrolases 1, DDAH1)/ 非對稱二甲基精氨酸 (asymmetric dimethylarginine,ADMA) /一氧化氮(nitric oxide,NO)信號通路有關(guān),miR-21表達(dá)下調(diào),可以通過DDAH1/ADMA/NO信號通路抑制TNF-α、IL-6和IL-17的表達(dá)[18]。此外,ARDS可以引起肺纖維化,從而加重病情[19],ARDS患兒血清miR-21表達(dá)水平升高,可能通過下調(diào)1 型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶 ( a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motifs,ADAMTS-1)的表達(dá)[20],促進肺纖維化,加重病情。本研究還記錄了ARDS患兒28 d病死情況,死亡亞組患兒入院時血清miR-21的表達(dá)水平、TNF-α、IL-6和IL-17水平明顯高于存活亞組,提示血清miR-21表達(dá)水平和炎性因子水平高的ARDS患兒預(yù)后較差,分析其原因可能是血清miR-21表達(dá)升高,調(diào)控炎性因子過表達(dá),激活炎性反應(yīng),形成炎性反應(yīng)級聯(lián)放大效應(yīng),進一步損傷肺組織,引起肺泡膜的通透性增加,大量的水腫液積聚在肺泡及肺間質(zhì)內(nèi),引起肺通氣和換氣功能嚴(yán)重障礙,以致患者肺組織不能進行有效的氣體交換,導(dǎo)致患者缺氧并伴有二氧化碳潴留,出現(xiàn)呼吸困難等癥狀,進而呼吸衰竭。本研究繪制血清miR-21水平判斷ARDS患兒預(yù)后的ROC曲線,血清miR-21曲線下面積為0.796,說明miR-21對ARDS患兒預(yù)后判斷具有一定的價值,其最佳臨界值為1.54,敏感度和特異度分別為78.57%和82.65%,說明血清miR-21表達(dá)水平可以用來輔助評估ARDS患兒的預(yù)后情況。
綜上所述,血清miR-21表達(dá)水平在ARDS患兒中明顯升高,并與疾病嚴(yán)重程度和炎性因子水平密切相關(guān),通過檢測血清miR-21的表達(dá)有助于評估患兒的病情嚴(yán)重狀況和預(yù)后情況。由于受到樣本量的限制,還需要進一步采用大型的隊列研究驗證血清miR-21表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度和炎性因子的關(guān)系,此外,還需要從分子生物學(xué)角度深入探究miR-21是通過何種信號通路增強了ARDS患兒的炎性反應(yīng),以明確miR-21在ARDS患兒致病過程中的作用,為臨床治療提供有價值的信息。
利益沖突:所有作者聲明無利益沖突
作者貢獻聲明
周莉蓉:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫,論文修改;王琪:實施研究過程,資料搜集整理;麥碧薇:進行統(tǒng)計學(xué)分析;朱乃云:課題設(shè)計;雷智賢:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核