胡 丹 羅玉斌 趙 毅 劉 毅 (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，瀘州 646000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，全球發(fā)病率為0.5%～1%[1]，目前發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。許多研究學(xué)者認(rèn)為主要與針對(duì)自身細(xì)胞結(jié)構(gòu)的自身抗體生成相關(guān)，且這些抗體可在未出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎臨床癥狀之前數(shù)年出現(xiàn)于患者血液中，提示觸發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫的首發(fā)部位可能存在于關(guān)節(jié)外的其他黏膜部位，比如胃腸道或呼吸道[2]。歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟2012年提出將RA相關(guān)遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素階段、RA相關(guān)環(huán)境因素階段、RA相關(guān)系統(tǒng)性自身免疫階段、無(wú)臨床關(guān)節(jié)炎癥狀階段總稱為RA臨床前期，即Pre-RA[3]。有研究表明Pre-RA在無(wú)自身免疫性組織損傷情況下已存在免疫反應(yīng)異常，如自身抗體(抗CCP抗體)水平異常，在遺傳和環(huán)境因素相互作用下啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織炎癥和損傷[4,5]。近年抗CCP抗體在黏膜免疫中的作用也受到人們的廣泛關(guān)注。有研究表明RA的始動(dòng)源于機(jī)體黏膜系統(tǒng)，可在患者唾液中檢測(cè)到IgA型抗CCP抗體，表明口腔黏膜可能發(fā)生了局限性的抗環(huán)瓜氨酸肽反應(yīng)(ACPA)[6,7]。故本實(shí)驗(yàn)擬探究抗CCP抗體增加的人群其腸道菌群是否會(huì)影響腸道黏膜屏障和免疫系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 FITC-conjugated dextran購(gòu)于Sigma，SYTOTMBC Green Fluorescent Nucleic Acid Stain購(gòu)于Thermo Fisher Scientific，PE anti-mouse IgA Antibody、Anti-Mouse CD19 APC、Ly6G:PerCP/cy5.5、BV421 Anti-Mouse CD127、PERCP-CY5.5 Anti-Mouse CD16/CD32、Anti-Mouse CD34 APC、PE CD117(ckit)mouse、Anti-Mouse Lineage FITC、PECY7 Anti-Mouse LY-6A/E(SCA-1)等抗體購(gòu)于eBioscience公司。

1.1.2儀器 多功能熒光酶標(biāo)儀購(gòu)于BioTek公司，TCL-16高速離心機(jī)購(gòu)于湘儀公司，流式分析分選儀購(gòu)于BD公司，Leica病理圖像定量分析系統(tǒng)購(gòu)于Leica。

1.1.3小鼠 6～8周齡DBA雌性小鼠，體重18～20 g，來(lái)源于四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2方法

1.2.1菌液制備 2017年 11月至 2018年3月間在四川大學(xué)華西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科共收集45份糞便標(biāo)本，其中 RA 患者組25份，ACPAs陽(yáng)性健康人群組10份，健康對(duì)照組10份； 采樣時(shí)盡量做到早晨空腹收集標(biāo)本，并保證環(huán)境清潔干燥，存放于-80℃冰箱。從-80℃冰箱取出糞便，放置于超凈臺(tái)，稱取0.6 g于5 ml EP管中。取1 ml 1×PBS于EP管中溶解糞便。向其中加入已消毒的磁珠，放置于振蕩器上充分振蕩攪勻。800 g離心3 min，取上清液用70 μm 的濾網(wǎng)過(guò)濾。得到的上清液用1×PBS稀釋成呈3 ml。

1.2.2抗生素處理小鼠 菌群移植前3 d，灌胃給予每只小鼠200 μl抗生素 (Vancomycin HLC、Neomycin sulfate、Metronidazole、Ampicillin)，連續(xù)處理3 d。

1.2.3菌群移植小鼠的建立 ①將29只抗生素處理過(guò)的DBA雌性小鼠分成三組，分別記為A組、B組、C組。A組(9只)為健康對(duì)照菌群移植組，B組(9只)為Pre-RA菌群移植組，C組(11只)為RA菌群移植組。②菌液保存在-80℃冰箱中，移植過(guò)程中需保存在冰袋中，移植當(dāng)天記為第1天。③抗生素處理連續(xù)處理3 d后，每組分別灌胃給予菌液100 μl，隔一天移植一次。④在第14天，將A組、B組、C組禁食禁水4 h后灌胃給予FITC-conjugated dextran(0.6 g/mg)。4 h后小鼠進(jìn)行麻醉，腹腔注射水合氯醛約150～200 μl/只。⑤留取標(biāo)本：外周血用于檢測(cè)中性粒細(xì)胞比例，而血清用于檢測(cè)腸道通透性，脾臟用于B細(xì)胞檢測(cè)。骨髓細(xì)胞用于骨髓干細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞檢測(cè)；小腸用于HE染色；糞便用于流式檢測(cè)腸道細(xì)菌包裹的SIgA；腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、派氏淋巴結(jié)用于檢測(cè)B細(xì)胞。

1.2.4多功能熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中FITC熒光強(qiáng)度(腸道通透性) 取100 μl的血清加入黑色96孔板，每組2個(gè)復(fù)孔，避光，每孔加入100 μl的PBS，輕輕吹打混勻，上機(jī)檢測(cè)血清中FITC熒光強(qiáng)度。

1.2.5糞便中腸道菌群IgA檢測(cè) 取1.2.2中50 mg 糞便標(biāo)本于5 ml EP管中，加1 ml含有1%BSA的PBS溶液，4℃孵育1 h。將磁珠放入EP管中，放在振蕩器上振蕩攪勻，運(yùn)行30 s，待其充分?jǐn)噭蚝箅x心10 min，吸取上清液，至新的離心管中。加入含有1%BSA的PBS溶液使樣品總體積為 1 ml，800 g離心5 min，棄去上清液，重復(fù)1次。再將1∶20 稀釋好的抗小鼠IgA抗體或同型對(duì)照50 μl樣品懸液中，避光4℃孵育20 min。加入1 000 μl含有1%BSA的PBS溶液，800 g 離心5 min，洗2次。然后將1∶400稀釋好的SYTO BC加入100 μl樣品懸液中，避光室溫孵育5 min。加入1 000 μl含有1%BSA的PBS溶液，800 g 離心5 min，洗1次。加入100 μl 含有1%BSA的PBS溶液和100 μl 8%多聚甲醛重懸樣品后上流式儀檢測(cè)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同部位淋巴結(jié)B細(xì)胞 將取出的淋巴結(jié)置于盛有PBS的培養(yǎng)皿中。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移到70 μm的篩網(wǎng)上，將篩網(wǎng)置于50 ml的離心管口，用5 ml注射器芯輕輕研磨淋巴結(jié)，不斷從培養(yǎng)皿中吸取PBS沖洗篩網(wǎng)。3 000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS輕輕吹打重懸細(xì)胞，分別取100 μl的細(xì)胞懸液于2管流式管中?？贵wCD19檢測(cè)B細(xì)胞，4℃孵育20 min。BSA 200 μl/管，打勻，1 400 r/min離心5 min，倒掉上清，剩余50 μl，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7流式檢測(cè)骨髓干細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞 分別取100 μl的骨髓細(xì)胞懸液于3管流式細(xì)胞管中，2 000 r/min離心5 min,棄上清。用Lin、Scal、c-kit、CD127、CD16/32、CD34檢測(cè)骨髓干細(xì)胞。用CD19檢測(cè)B細(xì)胞，Ly6G檢測(cè)中性粒細(xì)胞，避光4℃ 20 min。加入BSA 200 μl 清洗抗體，2 000 r/min 離心5 min，倒掉上清，剩余50 μl，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1菌群移植后腸黏膜屏障及腸道通透性的改變 移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠腸道通透性明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)。同時(shí)，組織學(xué)HE染色發(fā)現(xiàn)移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠腸道黏膜受損，絨毛發(fā)育不良，且絨毛間間隙增寬，進(jìn)一步證實(shí)腸道黏膜屏障被破壞(圖1B)，可致菌群及其代謝毒素可易位，影響機(jī)體健康。

2.2菌群移植后腸道SIgA包裹細(xì)菌的變化情況 腸內(nèi)容物中SIgA的含量越高表明腸道中需要被中和的細(xì)菌就越多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植Pre-RA和RA人群菌液后，小鼠腸內(nèi)容物中SIgA包裹細(xì)菌的含量不斷增加，且與移植健康對(duì)照組人群菌液相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如圖2。

2.3菌群移植后骨髓造血干細(xì)胞及前體細(xì)胞的改變情況 結(jié)果表明，Pre-RA和RA人群腸道菌群主要影響髓系祖細(xì)胞(CMP)和粒單核細(xì)胞系祖細(xì)胞(GMP)。移植菌群后，移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠CMP和GMP均高于健康對(duì)照組，且移植RA人群菌液組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如圖3。

2.4菌群移植后外周血中性粒細(xì)胞的表達(dá)水平 由圖3可知Pre-RA和RA菌群移植組小鼠骨髓中粒單核細(xì)胞系祖細(xì)胞(GMP)增多，進(jìn)一步觀察GMP分化成熟后的重要細(xì)胞類型即中性粒細(xì)胞的變化情況結(jié)果如圖4所示，移植Pre-RA和RA人群菌液組與健康對(duì)照組相比，小鼠外周血中性粒細(xì)胞也呈現(xiàn)相應(yīng)增加的趨勢(shì)，且移植RA人群菌液組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 腸道通透性和小腸結(jié)構(gòu)變化Fig.1 Intestinal permeability and small intestine struct-ure of miceNote: A.Fluorescence intensity.B.HE staining of small intestine.*.P<0.05.

圖2 小鼠糞便中SIgA包裹細(xì)菌的表達(dá)Fig.2 Expression of SIgA-encapsulated bacteria in mice fecesNote: *.P<0.05.

圖3 造血干細(xì)胞及各類前體細(xì)胞在骨髓中的比例Fig.3 Proportion of hematopoietic stem cells and various precursor cells in bone marrowNote: *.P<0.05.

圖4 小鼠外周血中性粒細(xì)胞比例Fig.4 Peripheral blood neutrophil ratio in miceNote: *.P<0.05.

圖5 不同免疫器官中B淋巴細(xì)胞的表達(dá)Fig.5 Expression of B lymphocytes in different immune organsNote: *.P<0.05.

2.5菌群移植后不同免疫器官中B細(xì)胞的表達(dá)情況 對(duì)脾臟、骨髓、派氏淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)等部位B淋巴細(xì)胞的比例進(jìn)行了檢測(cè)。與移植健康人群菌液對(duì)照組小鼠相比 ，移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在小鼠派氏淋巴結(jié)部位，移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠B淋巴細(xì)胞較移植健康人群菌液對(duì)照組小鼠有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如圖5。

3 討論

在易患RA的個(gè)體中，環(huán)境因素是誘發(fā)RA的重要因素之一。作為抗原來(lái)源的細(xì)菌和病毒成分可能誘導(dǎo)RA的發(fā)生，因此近年來(lái)它們作為潛在的致病因子備受人們關(guān)注。然而，迄今為止還沒(méi)有確鑿的證據(jù)表明微生物與RA的因果關(guān)系。

多種基因測(cè)序技術(shù)證實(shí)，RA患者腸道嗜血桿菌減少，乳桿菌豐度增加且這種改變與疾病的活動(dòng)度以及自身抗體滴度相關(guān)，提示腸道菌群在RA發(fā)病中起著重要的作用[8]?？笴CP抗體或RF陽(yáng)性在RA發(fā)病前十年即可檢出，而體外研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群紊亂持續(xù)刺激機(jī)體可導(dǎo)致RF分泌增加[9]，表明抗CCP抗體或RF因子陽(yáng)性而無(wú)關(guān)節(jié)炎癥狀的個(gè)體中，腸道菌群紊亂可持續(xù)存在并可能通過(guò)影響機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)，介導(dǎo)RA的發(fā)生[10]。前期研究證實(shí)在RA組、Pre-RA組、健康對(duì)照組三組中，腸道菌群發(fā)生了變化，在RA組普雷沃氏菌豐度增加，其中 Peptococcaceae、Gastranaerophilales、Coriobacteriaceae 等菌是和Pre-RA組共有的，兩組的益生菌屬Lachnoclostridium 菌屬豐度明顯低于健康對(duì)照組。

本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自Pre-RA和RA人群的腸道微生物導(dǎo)致小鼠腸道黏膜通透性增加及黏膜免疫反應(yīng)失衡，說(shuō)明可能RA相關(guān)的自身免疫和生物標(biāo)志物的改變可能起源于黏膜部位，進(jìn)而引起免疫系統(tǒng)失衡。有研究顯示特定黏膜位點(diǎn)的改變表明微生物因子可能會(huì)影響?zhàn)つっ庖叻磻?yīng)，這在RA的早期發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[11]。黏膜造成一定的破壞，使腸道黏膜通透性增加，引起菌群移位，在疾病的發(fā)展過(guò)程中起著誘導(dǎo)作用。

在內(nèi)外源性不同抗原刺激腸道黏膜時(shí)，腸道黏膜會(huì)產(chǎn)生大量的分泌型SIgA，抑制病原體黏附于腸上皮的表面，阻止病原體與腸黏膜穿透進(jìn)入腸道屏障，中和毒素且包裹有害病原體抗原。AS大鼠模型中腸道菌群失調(diào)，糞便中SIgA是由腸道中大量的細(xì)菌持續(xù)刺激腸黏膜后產(chǎn)生的，因此SIgA包裹細(xì)菌的表達(dá)能間接反映出腸道致病菌的數(shù)量[12]。本實(shí)驗(yàn)與此結(jié)論相同，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，移植Pre-RA人群腸道菌群的小鼠腸道屏障中SIgA的分泌增加，且RA組SIgA更高，因此失調(diào)的腸道菌群可通過(guò)一系列適應(yīng)性反應(yīng)激活產(chǎn)生SIgA的B淋巴細(xì)胞，最終導(dǎo)致SIgA的分泌增加，分泌的SIgA會(huì)進(jìn)一步包裹腸道中致病菌，阻止其與腸道黏膜接觸定植，避免對(duì)免疫系統(tǒng)的激活，故腸內(nèi)容物中SIgA包裹細(xì)菌的表達(dá)量增加。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RA人群的菌群移植后CMP和GMP水平增加，外周血中性粒細(xì)胞增多，說(shuō)明腸道菌群可通過(guò)影響造血干細(xì)胞及其前體細(xì)胞的發(fā)育而影響免疫細(xì)胞的早期發(fā)育。

Pre-RA階段自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)最明顯的改變，因?yàn)橛善浞置诘腁CPA在Pre-RA階段即有異常[13]。B淋巴細(xì)胞存在于腸道相關(guān)淋巴組織中，包括派氏淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)等。腸道微生物抗原和微生物代謝產(chǎn)物(SCFAs)會(huì)促進(jìn)黏膜及其他部位漿細(xì)胞的分化，促進(jìn)IgA的分泌[14]。在一項(xiàng)隨機(jī)雙盲試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)單次向RA高風(fēng)險(xiǎn)人群注射1 000 mg利妥昔單抗，造成B淋巴細(xì)胞的耗竭可延緩RA疾病的發(fā)展過(guò)程，說(shuō)明B淋巴細(xì)胞在臨床前階段(Pre-RA)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[15]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符，Pre-RA和RA組脾臟和派氏淋巴結(jié)部位B淋巴細(xì)胞明顯增加。 抗CCP抗體陽(yáng)性的Pre-RA和RA人群的腸道菌群不斷刺激小鼠腸道黏膜，引起黏膜免疫反應(yīng)，可通過(guò)外來(lái)抗原激活B淋巴細(xì)胞活化相關(guān)受體及其代謝產(chǎn)物直接調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞活化，也可通過(guò)腸道上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞間接調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞分化，導(dǎo)致派氏淋巴結(jié)和脾臟中B淋巴細(xì)胞增加。

此外，由于本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，還需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究腸道菌群對(duì)外周免疫器官T細(xì)胞及T細(xì)胞亞型的影響，本研究只是初步探討腸道菌群在Pre-RA階段發(fā)展為RA階段的發(fā)病機(jī)制。

綜述所述，Pre-RA和RA人群腸道菌群使小鼠腸道黏膜通透性增加，引起腸道局部黏膜免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸內(nèi)容物中SIgA的分泌增加，且派氏淋巴結(jié)和脾臟中B淋巴細(xì)胞增加。腸道微生物已被證明在RA中發(fā)揮重要作用，盡管它們之間關(guān)聯(lián)的機(jī)制仍不明確，但本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明腸道微生物在RA早期起著促進(jìn)疾病發(fā)展的作用，為今后治療RA提供了新的思路。