楊 彬 王郅杰 么宏強(qiáng) 鄧天健 額爾敦木圖 (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)

自噬可以保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞內(nèi)病原體的侵襲，但是自噬也可以被病原體利用以利于其存活[3]。細(xì)胞內(nèi)感染SA后，SA能夠破壞自噬體并逃逸到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并且抑制吞噬體與溶酶體的融合，此外，藥物誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SA的復(fù)制[4，5]。

研究發(fā)現(xiàn)紫外線抵抗相關(guān)基因(UV radiation resistance-associated gene,UVRAG)能夠與Beclin1等形成復(fù)合體從而促進(jìn)自噬[6]。A群鏈球菌在內(nèi)化、入侵宿主細(xì)胞過程中能夠通過某些分子(如NOD樣受體NLRX1)與Beclin1-UVRAG復(fù)合體相互作用，從而影響A群鏈球菌誘導(dǎo)的自噬及其侵入[7]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-xL通過與Beclin1-UVRAG相互作用抑制A群鏈球菌的內(nèi)化[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)UVRAG被SMAD特異性E3泛素蛋白連接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)泛素化能夠增強(qiáng)自噬的成熟[9]。國內(nèi)研究人員發(fā)現(xiàn)UVRAG與白血病的惡性進(jìn)展有關(guān)[10]。同時有研究顯示UVRAG參與了肝臟的脂肪變性[11]?？梢?，UVRAG的研究已成為一個熱點(diǎn)課題。然而，UVRAG能否調(diào)控SA誘導(dǎo)的自噬及其在胞內(nèi)的存活目前尚未見報道。因此，本研究通過SA刺激HeLa細(xì)胞建立體外感染模型，從細(xì)胞水平探討UVRAG對SA誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬及胞內(nèi)菌存活的影響。

1 材料與方法

1.1材料 HeLa細(xì)胞由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院張華教授惠贈；金黃色葡萄球菌ATCC29213由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院陳志寶教授惠贈；pCI-neo質(zhì)粒由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院周玉龍副教授惠贈；pCI-neo-HA-hUVRAG質(zhì)粒、EGFP-LC3質(zhì)粒購自Addgene公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；人UVRAG小干擾RNA由上海吉瑪公司合成；兔多克隆抗體LC3B購自Novus公司；小鼠單克隆抗體p62、兔多克隆抗體UVRAG、小鼠單克隆抗體GAPDH均購自Abcam公司；兔抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的兔抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司； RBITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京索萊寶生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HeLa細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的DMEM，置于37℃ 0.5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2UVRAG的RNA干擾及過表達(dá) 將HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，干擾UVRAG試驗分為對照組和UVRAG siRNA干擾組；過表達(dá)UVRAG試驗分為對照組(轉(zhuǎn)染pCI-neo質(zhì)粒)和過表達(dá)UVRAG組(轉(zhuǎn)染pCI-neo-HA-hUVRAG質(zhì)粒)。

1.2.3SA感染細(xì)胞 將SA(MOI=100)分別與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)1.5 h后，加入含有慶大霉素(100 μg/ml)的細(xì)胞培養(yǎng)液共培養(yǎng)30 min殺死胞外菌，更換培養(yǎng)液繼續(xù)分別培養(yǎng)HeLa細(xì)胞1、2、3、4、5 h，收集細(xì)胞后Western blot法檢測LC3B、p62及UVRAG的表達(dá)水平。

用上述同樣的感染方法將SA(MOI=100)分別感染干擾及過表達(dá)UVRAG的HeLa細(xì)胞1、2、3、4、5 h，收集細(xì)胞后Western blot法檢測LC3B、p62及UVRAG的表達(dá)水平。

1.2.4Western blot法檢測LC3B、p62及UVRAG的蛋白表達(dá)水平 裂解液RIPA裂解并提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法測定提取的蛋白濃度，將蛋白煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE分離，電泳后將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，分別用1∶1 000稀釋的LC3B、p62、UVRAG及GAPDH抗體進(jìn)行過夜孵育，用1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，漂洗后進(jìn)行ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影后用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

原譯：During the Yongzheng reign,the nine-peaches design was commonly seen on the famille-rose ware such as globular vases,olive-shaped vases and plates are decorated with branches that extend from the outside into the bowl.

1.2.5激光共聚焦顯微鏡觀察 將EGFP-LC3質(zhì)粒及pCI-neo-HA-hUVRAG質(zhì)粒用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，對照組將EGFP-LC3質(zhì)粒及pCI-neo質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后用SA感染，3 h后多聚甲醛固定細(xì)胞，用TritonX-100穿孔后封閉，加入1∶100稀釋的抗SA抗體孵育2 h，漂洗后加入1∶100稀釋的RBITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP-LC3的點(diǎn)狀聚集。

1.2.6平板計數(shù)法計算胞內(nèi)SA數(shù)量 分別轉(zhuǎn)染siRNA UVRAG和pCI-neo-HA-hUVRAG，24 h后分別用SA感染1、2、3、4、5 h，用含有0.5%的TritonX-100裂解細(xì)胞，將裂解液進(jìn)行梯度倍比稀釋，涂于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活菌平板計數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析進(jìn)行方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SA感染HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)生自噬 SA感染HeLa細(xì)胞1、2、3、4、5 h LC3 Ⅱ 的表達(dá)量與0 h的表達(dá)量相比顯著升高(P<0.05)，其中感染1 h和2 h的LC3 Ⅱ 的表達(dá)量達(dá)到最高，感染1 h和2 h的p62的表達(dá)量與0 h相比顯著降低(P<0.01)，SA感染HeLa細(xì)胞3 h、4 h和5 h的LC3 Ⅱ 的表達(dá)量與1 h和2 h的表達(dá)量相比顯著降低(P<0.05)，感染3 h、4 h和5 h 的p62的表達(dá)量與1 h和2 h的表達(dá)量相比顯著升高(P<0.05)。感染1、2、3、4、5 h的UVRAG表達(dá)量與0 h相比顯著升高(P<0.05)(圖1)。

2.2干擾或過表達(dá)UVRAG調(diào)控SA誘導(dǎo)的自噬 與對照組相比，感染1、2、3、4、5 h干擾UVRAG組LC3Ⅱ的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，p62的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(圖2)。

感染1、2、3、4、5 h過表達(dá)UVRAG組與對照組相比，LC3Ⅱ的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，p62的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖3)。

將SA(MOI=100)感染過表達(dá)UVRAG的HeLa細(xì)胞3 h，免疫熒光后用激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP-LC3的點(diǎn)狀聚集。結(jié)果顯示，過表達(dá)UVRAG組與對照組相比，EGFP-LC3的點(diǎn)狀聚集數(shù)量顯著升高(P<0.05)(圖4)。

圖1 SA感染HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.1 Autophagy was induced in HeLa cells infected with SANote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B,p62 and UVRAG.*.P<0.05 vs 0 h，#.P<0.01 vs 0 h，△.P<0.05 vs 1 h and 2 h，▲.P<0.05 vs 1 h and 2 h.

圖2 抑制UVRAG降低SA感染HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)的自噬水平Fig.2 Autophagy was suppressed in SA infected HeLa cells by siRNA knockdown of UVRAGNote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B and p62.*.P<0.05 vs NC.

圖3 過表達(dá)UVRAG升高SA感染HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)的自噬水平Fig.3 Autophagy was elevated in SA infected HeLa cells by over-expression of UVRAGNote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B,p62 and UVRAG.*.P<0.05 vs HA-UV.

2.3UVRAG調(diào)控胞內(nèi)SA的復(fù)制 將SA(MOI=100)分別感染干擾及過表達(dá)UVRAG的HeLa細(xì)胞1、2、3、4、5 h，平板計數(shù)法計算胞內(nèi)菌數(shù)量。結(jié)果顯示，干擾UVRAG使胞內(nèi)菌數(shù)量顯著上升(P<0.05)，過表達(dá)UVRAG使胞內(nèi)菌數(shù)量顯著下降(P<0.05)(圖5)。

3 討論

SA與自噬的相互作用具有其獨(dú)特的方式，SA通過降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的方式促進(jìn)自噬[12]。SA產(chǎn)生的α-溶血素參與自噬通路的激活，并且阻止自噬體的成熟[13]。α-溶血素還可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生來自于吞噬體的絲管狀結(jié)構(gòu)，而這些絲管似乎是SA胞內(nèi)復(fù)制所必需的[14]。體內(nèi)研究顯示自噬相關(guān)基因Atg16L1缺陷介導(dǎo)的對SA感染引起的膿毒癥和肺炎的易感性依賴于α-溶血素[15]。本研究用SA感染HeLa細(xì)胞1 h和2 h的LC3Ⅱ的表達(dá)量升高，感染3 h、4 h和5 h的表達(dá)量降低，SA感染細(xì)胞后LC3Ⅱ的表達(dá)量先升高后降低的趨勢與SA感染RAW264.7細(xì)胞引起LC3Ⅱ表達(dá)量的變化趨勢一致[16]。本研究SA感染HeLa細(xì)胞引起p62表達(dá)量的變化趨勢與SA感染NIH/3T3細(xì)胞引起的p62的表達(dá)量的變化趨勢一致[17]。此研究結(jié)果表明SA感染細(xì)胞后能夠引起并調(diào)控宿主細(xì)胞的自噬水平。

研究發(fā)現(xiàn)UVRAG能夠促進(jìn)自噬體的形成與成熟[18]，之后有研究發(fā)現(xiàn)一些miRNAs可以靶向UVRAG，并且通過調(diào)控UVRAG的蛋白表達(dá)從而調(diào)控自噬[19]。本研究用SA感染HeLa細(xì)胞發(fā)現(xiàn)UVRAG的蛋白表達(dá)量升高，研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒感染Huh7.5細(xì)胞也能夠引起UVRAG的蛋白表達(dá)量升高[20]。過表達(dá)UVRAG后感染SA LC3Ⅱ的表達(dá)量比未過表達(dá)UVRAG對照組的LC3Ⅱ的表達(dá)量升高，研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)UVRAG后感染結(jié)核分枝桿菌比未過表達(dá)UVRAG對照組的LC3Ⅱ的表達(dá)量升高[21]。過表達(dá)UVRAG后感染SA EGFP-LC3的點(diǎn)狀聚集比對照組的點(diǎn)狀聚集多，研究發(fā)現(xiàn)用Jurkat細(xì)胞過表達(dá)UVRAG后用激光共聚焦顯微鏡觀察點(diǎn)狀聚集升高[22]。此研究結(jié)果表明UVRAG可以調(diào)控SA感染誘導(dǎo)的自噬水平。

那么UVRAG能否調(diào)控SA的胞內(nèi)復(fù)制？本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)UVRAG后感染SA可以使胞內(nèi)SA數(shù)量降低，而干擾UVRAG后感染SA可以使胞內(nèi)SA數(shù)量升高。研究發(fā)現(xiàn)敲低BMDMs細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)菌數(shù)量也升高[21]，另外研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)UVRAG后感染丙型肝炎病毒可以降低病毒的復(fù)制[20]。宿主細(xì)胞中某些蛋白參與了自噬介導(dǎo)的胞內(nèi)SA的清除。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酶C相關(guān)催化活性蛋白(PRIP)參與的自噬能夠清除SA感染非專職吞噬細(xì)胞[23]。SA感染非專職吞噬細(xì)胞后被WIPI-1陽性的自噬體樣囊泡包裹，而且這些WIPI-1陽性的囊泡會被溶酶體降解[24]。那么，宿主細(xì)胞中還有哪些蛋白參與了自噬介導(dǎo)的胞內(nèi)SA的清除需要進(jìn)一步挖掘探索。