萬燁東 陳澤維 王楓 陳孝貞 盧俊青 毛紅嬌 侯瑋瑋 張云

1 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院（浙江紹興312000）

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院（浙江杭州310000 ）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是用人工材料制成的假體關(guān)節(jié)置換和代替損傷或病損關(guān)節(jié)，能有效減輕患者關(guān)節(jié)疼痛、重建關(guān)節(jié)功能，提高患者生活質(zhì)量，是目前治療晚期嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)疾病的最重要手段。然而，隨著關(guān)節(jié)置換病例的增加和時間的延長，假體晚期松動問題日益突出。大量研究表明，聚乙烯（polyethylene，PE）、鈦（titanium，Ti）和磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）等三類關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后，經(jīng)過長期磨損、碰撞產(chǎn)生大量的磨損顆粒，這些微米粒徑的細(xì)小顆粒聚集于假體表面會刺激假體周圍組織細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和白介素6（interleukin-6，IL-6），誘導(dǎo)假體周圍破骨細(xì)胞生成和炎癥性骨溶解[1-3]。目前治療假體周圍骨溶解主要有雙膦酸鹽和抗炎藥物，這些藥物雖然有一定的治療效果，但均存在諸多副作用，不宜長期服用。因此，尋找一種高效、毒副作用少，能長期應(yīng)用于治療假體周圍骨溶解及關(guān)節(jié)松動的藥物已迫在眉睫。

佛手苷內(nèi)酯（bergapten，BP）為一種天然的香豆素類化合物，廣泛存在于佛手、新鮮芹菜、檸檬、歐芹和歐防風(fēng)等食品中，具有抗炎、降血酯和抗腫瘤等活性[4，5]。以往研究與我們前期實驗結(jié)果顯示佛手苷內(nèi)酯可抑制核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成、存活及骨吸收[6，7]。而關(guān)于佛手苷內(nèi)酯對TCP 磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍炎癥性骨溶解的影響如何，目前尚不清楚。本研究應(yīng)用前期成功構(gòu)建的TCP磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，研究佛手苷內(nèi)酯對假體周圍骨溶解、破骨細(xì)胞生成、炎癥因子釋放、炎癥小體活化及細(xì)胞焦亡的影響，探討佛手苷內(nèi)酯對TCP 磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解的保護(hù)作用及分子機(jī)理，為研究防治假體周圍骨溶解及關(guān)節(jié)松動提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性6～8 周齡ICR 小鼠，體重18～22 g，清潔級，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（浙）2014-0001，合格證號1603090018。

1.2 小鼠顱骨溶解模型的構(gòu)建[3]與實驗分組

SPF級雄性6～8周齡ICR小鼠60只隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、TCP磨損顆粒組（TCP組）、佛手苷內(nèi)酯5 mg/kg 組（BP 5 mg/kg 組）、佛手苷內(nèi)酯10 mg/kg 組（BP 10 mg/kg 組）和佛手苷內(nèi)酯20 mg/kg 組（BP 20 mg/kg 組），每組12只。各組小鼠稱量體重后分別經(jīng)腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長約0.8 cm，分離皮下組織，露出面積為1 cm×1 cm 方形顱骨區(qū)域。其中Sham 組進(jìn)行原位縫合，其余四組取TCP磨損顆粒（30 mg）置于顱頂處后縫合皮膚。假手術(shù)和佛手苷內(nèi)酯組小鼠于術(shù)后第2 天于顱頂部位分別注射生理鹽水和佛手苷內(nèi)酯，隔日注射1 次，持續(xù)2 周。實驗結(jié)束后，各組小鼠稱量體重后通過摘除眼球取血；同時取出顱骨（以正中矢狀縫為中心的方形區(qū)域），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、濾紙吸去多余水分后分析天平稱量顱骨濕重（mg）。

1.3 測試指標(biāo)與方法

1.3.1 TRAP染色觀察假體周圍骨溶解

各組小鼠的顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min、超聲清洗5 min 后，置于系列梯度乙醇（50%、80%、90%和100%）中脫水，自然晾干后放入TRAP染色液中室溫避光染色60 min。PBS 清洗2 次后，置于IX70 顯微鏡下觀察顱骨表面侵蝕程度，并利用Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析正中矢狀線區(qū)域骨溶解面積。

1.3.2 HE染色觀察假體周圍破骨細(xì)胞生成

各組顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h 和10% EDTA（pH 7.4）脫鈣2周后進(jìn)行石蠟包埋，后經(jīng)切片機(jī)對顱骨矢狀面連續(xù)切片（厚度為7 μm），脫蠟后行HE 染色。每只小鼠顱骨隨機(jī)選取5張切片置于IX70顯微鏡下觀察3 個視野中破骨細(xì)胞生成情況變化。利用Image Pro-Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）軟件計算正中矢狀縫區(qū)域三個核及以上破骨細(xì)胞數(shù)目。

1.3.3 ELISA法檢測

實驗結(jié)束后，各組小鼠分別于眼眶后靜脈叢采血1.0 ml 置于EP 管中，待血液凝固后于（4 °C，3000 r/min）離心10 min，取上清液即為血清。

取96孔培養(yǎng)板，每孔加入20 μl血清，分別按照說明書檢測小鼠血清中TNF-α、IL-1β、白介素18（interleukin-18，IL-18）和RANKL水平。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)[8]

各組假體周圍骨組織加入RIPA 裂解液置于冰上裂解30 min。經(jīng)12000 r/min 離心15 min 收集上清液，應(yīng)用BCA?試劑盒檢測各組總蛋白濃度。每孔加入等量蛋白樣品行12%SDS-PAGE 分離，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，經(jīng)5%脫酯奶粉常溫封閉2 h后，分別加入兔抗NLRP3（1∶1000 稀釋）、兔抗ASC（1∶1000 稀釋）、兔抗IL-1β （1 ∶1000 稀釋）、兔抗cleaved caspase-1（1：1000 稀釋）和小鼠抗β-actin（1∶1000 稀釋）等單克隆抗體于4 °C 孵育過夜。次日經(jīng)TBST 洗滌3 次后加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次加入ECL 顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白表達(dá)的變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計處理用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，并利用紐曼-科伊爾斯（Newman-Keuls）檢驗進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重和顱骨濕重變化

表1顯示，從實驗開始至結(jié)束，Sham 組、TCP 組和BP 各劑量組小鼠體重均相似，無顯著性差異，表明BP對小鼠體重基本無影響。而各組小鼠的顱骨濕重差異明顯，表現(xiàn)為：與Sham組比較，TCP 組顱骨濕重明顯減少（P＜0.05）；與TCP組比較，BP組小鼠顱骨濕重顯著增加（P＜0.05），并呈一定的劑量依賴性（P＜0.05）。

表1 各組小鼠體重和顱骨濕重比較（n=12）

2.2 各組小鼠顱骨假體周圍骨溶解程度比較

與Sham 組比較，TCP 組小鼠顱骨假體周圍（正中矢狀縫）發(fā)生明顯骨溶解，骨溶解面積顯著增加（P＜0.05）；與TCP 組比較，BP 組小鼠顱骨表面骨溶解程度顯著減輕，其中BP 20 mg/kg 組的骨溶解面積減少更為明顯，僅為TCP 組小鼠骨溶解面積的37.13%（P＜0.05）。見圖1。

2.3 各組小鼠顱骨假體周圍破骨細(xì)胞生成比較

與Sham 組比較，TCP 組小鼠假體周圍破骨細(xì)胞生成顯著增多（圖2，P＜0.05），血清中TRAP 和capthesin K 活性及RANKL 含量明顯增加（表2，P＜0.05）；與TCP組比較，BP 組假體周圍破骨細(xì)胞生成明顯減少（圖2，P＜0.05），血清中TRAP、capthesin K 活性和RANKL 水平顯著減少（表2，P＜0.05）。

圖1 TRAP染色觀察小鼠假體周圍骨溶解情況（n=6）

圖2 HE 染色觀察小鼠假體周圍破骨細(xì)胞生成（n=6）

表2 各組小鼠血清中破骨細(xì)胞生成相關(guān)蛋白活性或含量的變化（n=12）

2.4 各組小鼠血清中炎癥因子釋放情況

與Sham組比較，TCP 組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-18水平明顯增加，分別為Sham組的1.79倍、3.54倍和2.78 倍（表3，P＜0.05）；與TCP 組比較，BP 組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-18 水平明顯減少（P＜0.05，表3）。

表3 ELISA法檢測各組小鼠血清中炎癥因子的水平（n=12）

2.5 各組小鼠假體周圍骨組織炎癥小體活化及細(xì)胞焦亡的比較

上述實驗結(jié)果顯示低劑量組（5 mg/kg）對TCP 磨損顆粒所致小鼠顱骨溶解及相關(guān)指標(biāo)的影響不明顯，且與TCP比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），故在此僅設(shè)10 mg/kg 和20 mg/kg 兩個劑量組研究BP 對炎癥小體活化及細(xì)胞焦亡的影響。Western blot結(jié)果顯示：與Sham 組比較，TCP 組小鼠假體周圍骨組織中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β表達(dá)均明顯上調(diào)，血清中IL-1β、IL-18 水平和LDH 釋放顯著增加（圖3，P＜0.05）。與TCP 組比較，BP 組骨組織中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β表達(dá)及血清中IL-1β、IL-18水平和LDH釋放明顯減少（表3、圖3，P＜0.05）。

圖3 Western blot法檢測小鼠假體周圍骨組織炎癥小體的活化（n=6）

3 討論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療終末期關(guān)節(jié)疾患、重建關(guān)節(jié)功能的重要手段。大量研究表明，人工關(guān)節(jié)假體經(jīng)過長期磨損、碰撞會產(chǎn)生大量的磨損顆粒包埋于假體周圍組織中，這些顆?？烧T導(dǎo)假體周圍組織細(xì)胞釋放多種炎癥因子，促進(jìn)假體周圍破骨細(xì)胞分化、骨溶解和關(guān)節(jié)晚期松動，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)置換失敗及關(guān)節(jié)二次翻修[1-3]。本研究首先應(yīng)用TRAP 染色證實了TCP 磨損顆?？烧T導(dǎo)小鼠顱骨中縫發(fā)生明顯的骨溶解，成功模擬了關(guān)節(jié)假體周圍磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解病理過程，與以往報道結(jié)果基本一致。這表明該模型可用于磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的干預(yù)治療。

佛手苷內(nèi)酯是從天然食品佛手、新鮮芹菜、檸檬、歐芹和歐防風(fēng)等中分離出來的一種香豆素類的化合物，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等藥理學(xué)作用。Ham等[9]報道佛手苷內(nèi)酯（折算后劑量約為20 mg/kg）喂養(yǎng)能增加小鼠股骨和脛骨的骨密度（bone mineral density，BMD）和骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume density，BV/TV），抑制破骨細(xì)胞的分化及形成，減少高脂飲食或四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。最近Chen[10]等研究認(rèn)為腹腔注射佛手苷內(nèi)酯（10 mg/kg、20 mg/kg）可顯著抑制卵巢切除引起的骨質(zhì)疏松小鼠脛骨的骨小梁結(jié)構(gòu)的變化而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松癥作用。本研究結(jié)果顯示佛手苷內(nèi)酯（5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg）明顯阻止假體周圍破骨細(xì)胞生成及骨溶解，并呈一定的劑量依賴性。其中佛手苷內(nèi)酯（20 mg/kg）對破骨細(xì)胞生成和骨溶解的抑制作用與Ham 等和Chen 等所報道的同劑量佛手苷內(nèi)酯對卵巢切除或糖尿病所造成的骨質(zhì)疏松癥小鼠骨溶解的影響相似[9，10]。

有證據(jù)表明破骨細(xì)胞膜上高表達(dá)的核因子受體κB激活蛋白（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和RANKL可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化[11]，同時分泌TRAP、cathepsin K 和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等蛋白酶降解或溶解骨基質(zhì)[12]，最終形成骨吸收窩陷。因此，RANKL水平及破骨細(xì)胞特征蛋白TRAP和cathepsin K 活性的改變常用來反映破骨細(xì)胞分化程度及功能狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)TCP磨損顆粒可明顯增加血清中RANKL 水平，并顯著上調(diào)TRAP 和capthesin K 的活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成及骨溶解。而佛手苷內(nèi)酯干預(yù)可劑量依賴性地抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的RANKL水平的上調(diào)及TRAP和cathepsin K活性的增加，阻止假體周圍骨溶解和破骨細(xì)胞的生成。

以往研究和我們前期實驗結(jié)果顯示TCP磨損顆粒可刺激假體周圍巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等多種因子，這些破骨細(xì)胞活化因子可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化并促進(jìn)骨吸收，提示炎癥因子在TCP 磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解中發(fā)揮重要作用，可作為假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)晚期松動的治療靶點。本研究通過ELISA 法檢測到TCP 磨損顆?？烧T導(dǎo)炎癥因子的釋放，增加血清中TNF-α、IL-1β和IL-18的含量；而佛手苷內(nèi)酯干預(yù)可顯著抑制上述炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)[4，13，14]及假體周圍炎癥性骨溶解。結(jié)合以往研究數(shù)據(jù)及本實驗研究結(jié)果表明，佛手苷內(nèi)酯具有較好的抗炎作用，它可通過減少炎癥因子的釋放而實現(xiàn)對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍炎癥性骨溶解的保護(hù)作用，但是其調(diào)控機(jī)制尚不明確。

炎癥小體及細(xì)胞焦亡的激活可引起強(qiáng)烈的炎癥小體反應(yīng)，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化、存活和骨吸收[15-17]，表明炎癥小體能調(diào)控炎癥性骨吸收疾病。炎癥小體是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種蛋白復(fù)合物，由NLRP3、ASC 和caspase-1等3部分構(gòu)成。NLRP3炎癥小體被激活后通過接頭蛋白ASC，募集半胱天冬氨酸蛋白酶1前體，進(jìn)而自我催化加工形成切割型caspase-1；活化的caspase-1 能切割I(lǐng)L-1β和IL-18 前體使其形成成熟的IL-1β和IL-18 并分泌至胞外，促進(jìn)細(xì)胞焦亡[18，19]。而抑制NLRP3 炎癥小體的活化及細(xì)胞焦亡，將緩解上述NLRP3 的異?；罨跋嚓P(guān)炎癥性疾病的癥狀[20]。Caiced等[21]證實敲除NALP3或ASC基因可阻止Co-Cr-Mo顆粒誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞THP1釋放IL-1β；Pierre[22]則認(rèn)為Ti 顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-1β與NALP3、ASC 和caspase-1的高表達(dá)密切相關(guān)。同樣PMMA顆粒介導(dǎo)的炎癥性骨溶解也與NLRP3的活化有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示TCP磨損顆粒可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的活化和細(xì)胞焦亡，表現(xiàn)為：與Sham組比較，TCP 組小鼠假體周圍骨組織中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1 和IL-1β表達(dá)均明顯上調(diào)，血清中IL-1β、IL-18 水平和LDH 釋放顯著增加。綜上，我們推測炎癥小體參與調(diào)控磨損顆粒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及破骨細(xì)胞生成和骨溶解。

佛手苷內(nèi)酯干預(yù)可顯著減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨組織中NLRP3 炎癥小體的活化與細(xì)胞焦亡，從而抑制caspase-1 的活化和成熟IL-1β和IL-18 等炎癥因子及LDH 的釋放，其趨勢與佛手苷內(nèi)酯對破骨細(xì)胞生成和骨溶解面積等指標(biāo)的影響基本一致，這表明佛手苷內(nèi)酯可通過減輕NLRP3 炎癥小體的活化，抑制炎癥因子的釋放而阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍炎癥性骨溶解。但是，關(guān)于佛手苷內(nèi)酯是否影響炎癥小體NLRP3活化之后的下游產(chǎn)物水平以及佛手苷內(nèi)酯是通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制炎癥小體NLRP3表達(dá)等問題還有待于后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

佛手苷內(nèi)酯可通過減弱炎癥小體的活化和細(xì)胞焦亡，抑制炎癥小體的釋放而阻止TCP 磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解及關(guān)節(jié)松動。