鄔素珍,吳聲振,吳向維
(廣東省佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院,廣東 佛山 510530)
中藥膏方因口感好、攜帶方便等優(yōu)點[1],逐漸成為人們養(yǎng)生保健的重要選擇。中藥膏方是中藥的特有劑型,制作過程需經(jīng)浸泡、煎煮、過濾、濃縮、收膏、涼膏、分裝等復(fù)雜工序,需進行嚴格的質(zhì)量控制,以保證制劑安全有效[2-5]。中藥膏方制作過程不添加防腐劑,因其含水量低,滲透壓高,可有效抑制微生物滋生,常溫下可存放90 d 以上[6-8],但其有效成分在貯存過程是否發(fā)生變化尚不明確。卵巢護養(yǎng)膏是由二仙湯加減組成,臨床用于治療腎虛證卵巢儲備功能不全、骨質(zhì)疏松癥、老年性失眠等更年期癥狀[9-11],需長期服用。為保證治療期間膏方功效穩(wěn)定,本研究中以微生物限度、相對密度、淫羊藿苷含量為指標,研究其貯存期間的質(zhì)量變化,為膏方的服用期限提供試驗依據(jù)?,F(xiàn)報道如下。
儀器:LC-20AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司),BT25S 型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司,精度為十萬分之一);微壓中藥煎煮機(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司);KQ2200E 型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);GZX-9023 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司);并聯(lián)式中藥膏方濃縮制備系統(tǒng)(自主研發(fā),專利號為201620659405.0)。
試藥:淫羊藿苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號為110737-201516);水為重蒸水,其他試劑均為色譜純;仙茅、淫羊藿、浮小麥、巴戟天等中藥飲片,均購自廣州至信藥業(yè)股份有限公司,經(jīng)佛山市食品藥品檢驗檢測中心鐘然主任藥師鑒定為正品;卵巢護養(yǎng)膏(醫(yī)院制劑,批號分別為1080601,1080602,1080603)。
根據(jù)2015年版《中國藥典(四部)》通則[12]中微生物計數(shù)法(通則1105)和控制菌檢查法(通則1106)進行操作,于第0,10,20,30,60,90,120 天對3 批供試品進行抽樣檢定。結(jié)果供試品在120 d 內(nèi)的細菌菌落計數(shù)均不超過10 cfu/mL(限度標準為≤100 cfu/mL),表明微生物限度符合規(guī)定,且均未檢出大腸埃希菌和沙門菌,詳見表1。
2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗
色譜柱:AmethystC18-H 柱(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(30 ∶70,V/ V);檢測波長:270 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計不低于1 500。
2.2.2 溶液制備
對照品溶液:取淫羊藿苷對照品適量,精密稱定,置容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,即得(質(zhì)量濃度為360 μg/mL)。
供試品溶液:淫羊藿藥材按處方調(diào)配后,加8 倍藥材質(zhì)量的水,置不銹鋼桶浸泡4 h,待藥材充分吸脹后,置并聯(lián)式中藥膏方濃縮制備系統(tǒng)中煎煮3 次,每次煎煮1 h,濾過,濾液濃縮至相對密度為1.2 ~1.3 的稠膏,分裝至玻璃廣口瓶中,待涼膏后密封保存。取供試品,105 ℃下真空干燥3 h 后,冷卻至室溫,取0.5 g,精密稱定,加甲醇20 mL,超聲處理30 min,濾過,蒸干,殘渣加甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
表1 卵巢護養(yǎng)膏微生物限度檢測結(jié)果(cfu/mL)
陰性對照品溶液:按處方比例稱定除淫羊藿外的所有藥材,按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。
2.2.3 方法學(xué)考察
專屬性試驗:分別取2.2.2 項下3 種溶液,按擬訂色譜條件進樣分析,記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照無干擾,表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。
線性關(guān)系考察:精密吸取不同體積的對照品溶液,置10 mL 容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得質(zhì)量濃度為180,120,90,45,15 μg/mL 的系列溶液。按擬訂色譜條件測定峰面積,以對照品質(zhì)量濃度(X,μg/mL)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程Y=39 862X+82.18,r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明,淫羊藿苷質(zhì)量濃度在15 ~180 μg /mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。
檢測限與定量限確定:精密量取質(zhì)量濃度為15.0 μg /mL 的對照品溶液1 mL,置10 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻。依次改變進樣量,測定檢測限和定量限。信噪比(S/ N)約為1 ∶3 時,進樣量為5 μL,測定檢測限絕對值為7.5 ng;S/ N約為1 ∶10 時,進樣量為20 μL,測定定量限絕對值為30 ng。
精密度試驗:精密吸取質(zhì)量濃度為90μg/mL 的對照品溶液,按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6 次,記錄淫羊藿苷的峰面積。結(jié)果的RSD為1.05%(n=6),表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗:取同一批供試品溶液,分別于制備后0,2,4,6,8,12 h 時進樣,記錄淫羊藿苷峰面積。結(jié)果的RSD為1.27%(n=6),表明供試品溶液12h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
重復(fù)性試驗:取同一批樣品,依法平行制備6 份供試品溶液,記錄淫羊藿苷的峰面積。結(jié)果的RSD為1.03%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。
加樣回收試驗:取已知含量的樣品( 批號為1080601)6 份,每份約0.25 g,精密稱定,分別按樣品含量-加入量1 ∶1 的比例加入一定量的對照品溶液,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件測定,計算回收率。結(jié)果見表2。
表2 淫羊藿苷加樣回收試驗結(jié)果( n =6)
按2015年版《中國藥典(四部)》通則0183[12]煎膏劑項下規(guī)定,取3 批供試品,每批各3 瓶,進行相對密度測定。結(jié)果樣品相對密度在120 d 內(nèi)穩(wěn)定,詳見表3。
圖1 高效液相色譜圖
表3 卵巢護養(yǎng)膏貯存期間相對密度質(zhì)量研究結(jié)果
取3 批供試品,常溫下貯存120 d,使用清潔的干燥藥匙,分別在第0,10,20,30,60,90,120 天抽樣,檢測其淫羊藿苷的含量。結(jié)果見表3??梢?,淫羊藿苷含量在90 d內(nèi)相對穩(wěn)定,第120 天略有下降。
本研究中分別以甲醇和稀乙醇為溶劑,超聲提取30 min,結(jié)果甲醇提取的供試品溶液中淫羊藿苷含量更高,故確定甲醇為提取溶劑。分別超聲提取10,20,30,40 min,結(jié)果測得淫羊藿苷含量最高的是提取30 min 與40 min,故選擇甲醇超聲提取30 min 作為供試品溶液的制備方法。以不同比例的甲醇-水、乙腈-水為流動相進行試驗,結(jié)果流動相為乙腈-水(30 ∶70,V/ V)時理論板數(shù)更高,分離度更好,故選擇乙腈-水(30 ∶70,V/ V)為流動相。
中藥膏方對原料來源、制作工藝、貯存容器要求較高,質(zhì)量控制不當(dāng)易導(dǎo)致膏方貯存期間微生物限度超標。相對密度是評價膏方質(zhì)量的指標之一,可間接反映中藥膏方的含水量,相對密度越低,含水量越高的膏方更易霉變[13-15]。故本研究中以微生物限度及相對密度為卵巢護養(yǎng)膏的質(zhì)量評價指標,考察其貯存過程含水量的變化。
卵巢護養(yǎng)膏在貯存過程相對密度始終維持在1.2 ~1.3 間,此狀態(tài)下膏方表面光滑,流動性好,口感光滑。貯存期間微生物限度考察合格,表明膏方在此含水量下可長期存放,符合質(zhì)量控制要求。同時說明其包裝容器可有效隔絕外界水分侵入,防止微生物滋生,為包裝的選用提供了有力的佐證。貯存期間淫羊藿苷含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),其在90 d 內(nèi)穩(wěn)定,此后開始下降,降幅約為10%,故卵巢護養(yǎng)膏在常溫下的保存期限以120 d為宜。改變貯存條件是否會對其保存期限造成影響,需在下一步的試驗設(shè)計中完善。