王 冠，王 瑩，阮 磊，吳曉芬，張存泰△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 1綜合科 2病理科，武漢 430030

心力衰竭(heart failure,HF)往往提示心血管疾病的最后階段，死亡率及致殘率高，為公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了巨大負擔[1]。小鼠作為心血管疾病常用模型，探討其心衰模型的特點無疑為我們防治該疾病提供了可能。速度向量成像技術(shù)(velocity vector imaging,VVI)以斑點追蹤為原理，通過逐幀掃描感興趣區(qū)域心動周期內(nèi)的位移，進而測算出運動速度、應(yīng)變及應(yīng)變率等指標，為探索心臟心肌力學改變提供了新方法[2]。本研究應(yīng)用分層斑點追蹤(layer specific-speckle tracking echocardiography,LS-STE)技術(shù)觀察壓力超負荷所致心衰小鼠左心室內(nèi)、外膜下的心肌力學改變，及其與心肌纖維化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和分組

選擇8周齡，體重18～24 g的雄性C57BL/6小鼠23只，隨機分為手術(shù)組和假手術(shù)組，手術(shù)組13只小鼠，假手術(shù)組10只小鼠。上述動物均購于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，所有實驗方案均經(jīng)華中科技大學同濟醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 小鼠心衰模型的建立

依照經(jīng)典文獻[3]，手術(shù)組小鼠通過戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔麻醉，當小鼠完全麻醉后置于37℃恒溫加熱板上，隨后在左胸第1肋間隙上行胸廓切開術(shù)，暴露主動脈弓，在小鼠無名動脈及左頸總動脈處放置28號針頭，用7-0縫線結(jié)扎，隨后快速拔走針頭，造成主動脈狹窄，然后逐層關(guān)閉胸壁。假手術(shù)組除未用縫線結(jié)扎外其余手術(shù)步驟與手術(shù)組相同。

1.3 超聲心動圖采集數(shù)據(jù)

用3%異氟烷吸入誘導麻醉小鼠，待翻正反射消失后，維持異氟烷濃度1%～2%繼續(xù)麻醉小鼠，使小鼠既能配合實驗，同時心率在420次/min以上，以避免麻醉對心功能的抑制。小鼠麻醉后置于加熱板上，維持體溫為37℃，隨后胸部脫毛，應(yīng)用Vevo2100小動物超聲儀及配備的MS-400探頭(采樣頻率>30 MHz)，B-mode和M-Mode下采集胸骨旁左室長軸切面及左室短軸切面圖像，然后分別測量計算出左室后壁厚度(LVPWT)、左室舒張期末內(nèi)直徑(LVEDD)、左室收縮期末內(nèi)直徑(LVESD)、左室重量和左室短軸縮短率(FS)等指標。

選擇心室內(nèi)外膜邊界清晰的左室短軸切面和長軸切面圖像導入VevoStrain定量分析軟件，手動描繪心室內(nèi)外膜。描繪過程中越過乳頭肌及肌小梁等結(jié)構(gòu)。描繪結(jié)束后儀器自動將心室劃分為固定節(jié)段，隨后通過模式匹配，自動逐幀地追蹤心動周期中各節(jié)段心室內(nèi)外膜的形變和時程，進而測算出心室各個節(jié)段內(nèi)外膜的應(yīng)變、室壁最大達峰延遲時間(maximal opposite wall delay，MOWD)等指標(圖1)。

A：分層斑點追蹤在長軸切面測定內(nèi)外膜各階段應(yīng)變及達峰時間；B：分層斑點追蹤在短軸切面測定內(nèi)外膜各階段應(yīng)變及達峰時間圖1 分層斑點追蹤應(yīng)變成像Fig.1 Layer specific-speckle tracking strain echocardiography

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)組心衰模型的建立

手術(shù)組13只小鼠明顯表現(xiàn)出心衰特征，即昏睡、移動力減低、呼吸困難及水腫，其中2只小鼠在術(shù)后1周內(nèi)死亡，1只在術(shù)后3周內(nèi)死亡，術(shù)后第3周手術(shù)組存活10只，存活率為77%，假手術(shù)組的存活率為100%。3周后尸檢結(jié)果和常規(guī)超聲結(jié)果亦提示相比假手術(shù)組，手術(shù)組心臟重量和體重的比值(HW/BW)及肺臟重量和體重的比值(LW/BW)均明顯增大，LVEDD、LVESD明顯升高，LVPWT減低，F(xiàn)S明顯下降，心室變薄(均P<0.05，圖2、表1)。

圖2 術(shù)后第3周小鼠心臟尸檢結(jié)果Fig.2 Gross observation of hearts of mice three weeks after surgery

表1 各組術(shù)后第3周常規(guī)超聲學參數(shù)比較Table 1 Comparison of conventional echocardiographic parameters three weeks after surgery

與假手術(shù)組比較，*P<0.05

2.2 手術(shù)組和假手術(shù)組間內(nèi)外膜速度向量成像參數(shù)比較

相比假手術(shù)組，手術(shù)組的MOWD表現(xiàn)為明顯延長；應(yīng)變值也表現(xiàn)為內(nèi)外膜縱向、環(huán)向應(yīng)變及徑向應(yīng)變值顯著低于假手術(shù)組(均P<0.05，表2，3)。

2.3 手術(shù)組和假手術(shù)組內(nèi)外膜速度向量成像參數(shù)的梯度差異

假手術(shù)組及手術(shù)組在環(huán)向及縱向均表現(xiàn)為內(nèi)膜應(yīng)變大于外膜應(yīng)變；假手術(shù)組及手術(shù)組在環(huán)向及縱向均表現(xiàn)為內(nèi)膜MOWD小于外膜MOWD(均P<0.05，表2，3)。

2.4 速度向量成像參數(shù)與心肌纖維化的相關(guān)性

手術(shù)組纖維化面積占左室總面積(1.74±0.15)%，明顯高于假手術(shù)組的(0.29±0.07)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。根據(jù)組織病理切片(圖3)所測得的內(nèi)外膜縱向和環(huán)向應(yīng)變與心肌纖維化程度顯著相關(guān)(r=-0.85，-0.81，-0.88，-0.86，P<0.05，圖4)。

表2 比較術(shù)后第3周不同組之間及各組內(nèi)的內(nèi)、外膜下應(yīng)變值Table 2 Comparison of endocardium and epicardium strain values between different groups and within each group three weeks after

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與內(nèi)膜比較，#P<0.05

表3 比較術(shù)后第3周不同組之間及各組內(nèi)的內(nèi)、外膜達峰時間Table 3 Comparison of endocardium and epicardium maximal opposite wall delay between different groups and within each group three weeks after

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與內(nèi)膜比較，#P<0.05

A：假手術(shù)組小鼠術(shù)后第3周心肌纖維化損傷；B：手術(shù)組小鼠術(shù)后第3周心肌纖維化損傷圖3 術(shù)后第3周左室心肌纖維化(Masson-some染色法)Fig.3 Fibrotic lesion of left ventricle three weeks after surgery (Masson-some staining)

A：纖維化面積占左室總面積與內(nèi)膜下縱向應(yīng)變的相關(guān)性；B：纖維化面積占左室總面積與外膜下縱向應(yīng)變的相關(guān)性；C：纖維化面積占左室總面積與內(nèi)膜下環(huán)向應(yīng)變的相關(guān)性；D：纖維化面積占左室總面積與外膜下環(huán)向應(yīng)變的相關(guān)性圖4 左室心肌纖維化程度與應(yīng)變指標的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between the fibrotic lesion of left ventricle and strain parameters

3 討論

本文通過主動脈縮窄術(shù)復制壓力后負荷增加所致的心力衰竭模型。術(shù)后1周，小鼠表現(xiàn)為精神差、移動力減低、昏睡等一系列癥狀。術(shù)后第3周，上述癥狀更為明顯，常規(guī)M型超聲提示心動周期中心室壁收縮明顯減低。這無疑提示該模型可有效模擬病理狀態(tài)下的心力衰竭。實際上既往多個研究也證實了上述造模方法的可靠性[4-5]。

研究表明心臟并不能看成是一個“合體”細胞。它的“泵”功能的實現(xiàn)包括內(nèi)膜下右手螺旋形心肌、外膜下左手螺旋形心肌的縱向縮短以及中層心肌的環(huán)向增厚組成，這無疑提示心肌存在跨膜異質(zhì)性，因此有必要分層研究心肌的力學特點[6-7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，無論是生理狀態(tài)下還是病理狀態(tài)下的小鼠，在縱向和環(huán)向均表現(xiàn)為內(nèi)膜下應(yīng)變明顯高于外膜下應(yīng)變。這與既往應(yīng)用TDI技術(shù)或速度向量成像技術(shù)在人體的研究相符，說明對小鼠心肌分層行斑點追蹤可有效評價心功能，小鼠模型可完美模擬人體心肌的力學特點，在小鼠模型得到的結(jié)果對臨床有很好的借鑒意義[8-9]。我們發(fā)現(xiàn)小鼠心肌內(nèi)膜應(yīng)變高于外膜應(yīng)變，內(nèi)膜MOWD小于外膜MOWD。這是心室內(nèi)外膜心肌力學差異性所致。具體來說，心動周期中心臟收縮主要以心內(nèi)膜收縮為主導，外膜下心肌的收縮一方面依賴于心肌纖維本身，也一定程度依賴于內(nèi)膜纖維等的牽拉效應(yīng)，因此相比心外膜，心內(nèi)膜形變更加顯著，而達到最大形變程度所需時間較短[10]。其他課題組進一步分析內(nèi)外膜單個心肌細胞收縮幅度也證明心內(nèi)膜下單個心肌細胞收縮幅度更大，達峰更快，無疑從微觀上證實了上述觀點[11]。

隨后我們發(fā)現(xiàn)心衰小鼠內(nèi)外膜縱向、環(huán)向應(yīng)變以及徑向應(yīng)變均低于對照組，這是由于小鼠心功能減低，收縮功能下降所致。而心衰小鼠內(nèi)外膜MOWD表現(xiàn)為明顯增大，提示各節(jié)段心肌的協(xié)同性減低，與心衰心肌凋亡壞死、心肌纖維化導致心肌排列雜亂無序、僵硬度增加有關(guān)。而Masson-some染色也證實心衰小鼠心肌中的膠原組織更多，提示纖維化程度更重，相關(guān)性分析則進一步證實分層速度向量成像所測指標與心肌纖維化密切相關(guān)。

綜上，本研究表明心肌分層速度向量技術(shù)可評估小鼠生理及病理狀態(tài)下的心肌力學特點，一方面為未來動物實驗提供了參考值，也為探索心力衰竭機制提供了新的視角。該方法的局限性在于：①分層速度向量需較高的圖像分辨率才能識別心肌內(nèi)外膜，對超聲設(shè)備要求較高，限制了其廣泛應(yīng)用；②該方法只能測定心肌二維平面內(nèi)縱向、環(huán)向及徑向運動，而心肌運動是三維過程，忽視了心肌二維平面外的運動。