金軼 ，陳斌 ，丁帆 ，成仙葉 ，李謝倫 ，陳芳 ，蘇東明

（1.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南京210029；2.南京醫(yī)科大學，南京210029）

紫外線（Ultraviolet，UV）導致皮膚損傷的機制十分復雜，大量研究表明氧化應激是UV造成皮膚損傷的重要原因。UV可以干擾細胞信號轉導過程，促進皮膚成纖維細胞產生過量活性氧簇（ROS），一旦ROS生成量超過機體抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，即激活細胞氧化應激，導致細胞損傷[1]。核因子E2相關因子（Nrf）2已被證實是一種調節(jié)體內氧化平衡的關鍵因子，激活Nrf2介導的抗氧化損傷通路可以維持皮膚正常的屏障功能，從而保護皮膚細胞免受UV誘導的損傷[2]。當UV照射激活細胞氧化應激后，細胞內質網功能發(fā)生紊亂，錯誤折疊蛋白增多，稱為內質網應激（ER stress），為了應對 ER stress，哺乳動物細胞內會激活一系列信號通路，稱為未折疊蛋白反應（UPR），包括暫時停止早期蛋白質的合成和誘導內質網相關蛋白的降解（ERAD）等，羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白（Hrd）1是位于內質網膜上的一種E3泛素連接酶，又稱為滑膜素（Synoviolin），其在識別、轉運和泛素化折疊錯誤的蛋白的過程中起著重要作用。多種研究表明Hrd1與類風濕性關節(jié)炎[3]、阿爾茨海默病[3]、肝臟纖維化[5]、腎纖維化[6]、帕金森病[7]、癌癥[8]等的發(fā)生有關。Wu等[5]的研究證實Hrd1是Nrf2的特異性E3泛素連1接酶，Hrd1的C端通過與Nrf2的Neh4-5區(qū)域相結合，對Nrf2進行泛素化，然后蛋白酶體識別并進一步降解Nrf2，加重細胞氧化損傷。

筆者前期研究發(fā)現，紫外線照射可明顯促進皮膚成纖維細胞中Hrd1的表達，但Hrd1與Nrf2在人皮膚成纖維細胞中的表達是否存在關聯(lián)，目前仍缺乏相關研究[9-10]。本實驗通過收集臨床標本及體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，進一步探討UV照射與成纖維細胞中Hrd1、Nrf2表達水平的關系，以及Hrd1與Nrf2之間的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Hrd1一抗（兔抗人多克隆抗體，美國Abcam公司）、Nrf2一抗（兔抗人單克隆抗體美國abcam公司）、β-actin一抗（CST公司）、羊抗兔二抗（美國Thermo公司）、熒光抗兔二抗（美國Thermo公司），熒光抗羊二抗（美國Thermo公司），PV-6000試劑盒（北京中杉金橋有限公司）；Lipofetamine 2000（美國 Thermo公司）；protein a/G agarose beads（美國Thermo公司）；臺式紫外線輻射儀（美國Sigma公司）；LSM 700激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss AG）。

1.2 方法

1.2.1 臨床標本收集 臨床皮膚標本來自2018年12月—2019年6月南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科患者淺表良性腫物病灶周圍正常皮膚，共12例，均為女性。曝光部位皮膚取自面頸部，避光部位皮膚取自胸背部、大腿及臀部。根據部位將標本分為2組，每組6份，組1來自避光部位，平均年齡（40.30±10.19）歲，組2來自曝光部位，平均年齡（40.10±10.31）歲。本研究通過南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（2016-SRFA-033）。

1.2.2 免疫組化檢測人皮膚中Hrd1和Nrf2表達 人皮膚組織用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟，并進行抗原修復，然后滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，常溫孵育，一抗4℃孵育過夜（Hrd1濃度為1∶150，Nrf2 濃度為 1∶200），滴加酶標羊抗兔 IgG 聚合物，37℃孵育；二氨基聯(lián)苯胺染色液顯色，然后復染、脫水、透明、封片。使用DP2-BSW采集圖片，用Image J軟件對圖片進行半定量分析，計算平均光密度值（平均光密度值=IOD值/面積）。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 取包皮環(huán)切手術患者的包皮標本，分離培養(yǎng)原代人成纖維細胞，方法參照文獻[10]。人成纖維細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。選用4～8代處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.4 細胞照光 細胞分為對照組、長波紫外線（UVA）組、中波紫外線（UVB）組。UVA組和UVB組照光前用磷酸鹽緩沖液（PBS）覆蓋細胞上層，照射劑量為10 J/cm2UVA或30 mJ/cm2UVB。UVA組和UVB組（紫外線照射后）繼續(xù)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.5 細胞蛋白提取及Western blot法檢測細胞中Hrd1和Nrf2的表達 提取細胞蛋白：將體外培養(yǎng)的各組人皮膚成纖維細胞加入0.25%胰酶，于37℃孵育5 min，加入等量PBS后離心，棄上清，沉淀物加入裂解緩沖液（RIPA）中，靜置20 min后離心（4℃，12 000 轉/min，20 min），棄沉淀，取上清，根據蛋白濃度進行配平，然后加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min后置于-20℃保存。

Western blot：將含有等量蛋白的樣品上樣后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，室溫下，用5%脫脂奶粉封閉非特異性蛋白1 h。加入一抗（Hrd1濃度為1∶200，Nrf2濃度為1∶1 000），4℃冰箱中過夜，次日洗滌緩沖液（TBST）洗 3次，15 min/次，加入過氧化物酶標記的二抗室溫下結合1.5 h，再用TBST洗3次。采用ECL化學發(fā)光試劑反應5 min，利用凝膠自動成像儀成像。采用Image J軟件進行半定量分析，數據表達為Hrd1和Nrf2蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值。

1.2.6 細胞siRNA轉染 人靶向Hrd1基因的小干擾RNA（siRNA）由廣州銳博生物技術有限公司的專業(yè)軟件設計，si-Hrd1-1序列為5'-CCAUGAGGCAGUUCAAGAAdTdT-3'，si-Hrd1-2 序列為5'-UGUCUGGCCUUCACCGUUU-3’。轉染前取處于對數生長期且生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%胰酶消化后，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞生長至60%～70%匯合后，用LipofectamineTM2000轉染，轉染方法參照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行。轉染后于培養(yǎng)箱內孵育5～6 h，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，用于后續(xù)實驗研究。

1.2.7 免疫熒光 將細胞轉移至激光共聚焦專用培養(yǎng)板內，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，PBS中洗3次，多聚甲醛固定30 min（室溫），再用1%Triton-X 100在室溫通透15～30 min后，加入二抗同源血清封閉 1 h，滴加一抗（Hrd1 濃度為 1∶50；Nrf2 濃度為1∶100）室溫孵育 1 h，PBST 洗 3 次后，滴加熒光二抗避光孵育45 min，封片，使用LSM700共聚焦激光掃描顯微鏡（Zeiss AG）進行圖像采集。

1.2.8 免疫共沉淀 細胞裂解物中分別加入Hrd1抗體、Nrf2抗體、對照IgG抗體，孵育1 h，隨后加入ProteinA/G瓊脂糖珠，4℃過夜，次日離心（4℃，14 000轉/min，1 min），棄上清，用裂解緩沖液洗 3次后加入1×SDS上樣緩沖液重新懸浮，95℃水浴5 min，后續(xù)進行 Western blot，檢測 Hrd1和 Nrf2的表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hrd1和Nrf2在人體皮膚中的表達 首先，筆者應用免疫組化法檢測Hrd1及Nrf2在不同部位人皮膚組織中的表達，結果如圖1所示，不同部位人皮膚標本中，均可發(fā)現成纖維細胞Hrd1及Nrf2的表達，曝光部位皮膚組織中Hrd1表達（0.4756±0.0785）明顯高于避光部位（0.1270±0.0253，t=7.317，P＜0.05），曝光部位皮膚組織中Nrf2表達（0.119 0±0.021 7）明顯低于避光部位（0.262 9±0.026 3，t=7.306，P＜0.05），提示紫外線照射可以增加皮膚組織中Hrd1的表達，并且抑制Nrf2的表達。

2.2 UV照射對體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞中Hrd1和Nrf2表達的影響 筆者進一步在體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞中驗證了上述結果，將體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞分為3組，分別為對照組、UVA組、UVB組，Western blot結果如圖2顯示：對照組、UVA組、UVB組的Hrd1蛋白水平分別是0.505 9±0.108 3、1.186 0±0.121 8、0.886 3±0.192 7，差異有統(tǒng)計學意（F=16.42，P＜0.05）；對照組、UVA 組、UVB組的Nrf2蛋白水平分別是1.174 0±0.064 7、0.401 8±0.196 9、0.395 3±0.076 1，差異有統(tǒng)計學意義（F=37.05，P＜0.05）。UVA 組與對照組相比，Hrd1蛋白表達水平明顯增高（t=7.227，P＜0.05），Nrf2 蛋白表達水平明顯下降（t=6.456，P＜0.05）；UVB 組與對照組相比，Hrd1蛋白表達水平明顯增高（t=2.980，P＜0.05），Nrf2蛋白表達水平明顯下降（t=13.52，P＜0.05）。

2.3 在體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞中下調Hrd1的表達對Nrf2的影響 為了檢測Hrd1和Nrf2在細胞內表達水平的關系，應用Hrd1-SiRNA轉染體外培養(yǎng)人纖維細胞后，用Western blot檢測細胞內Hrd1蛋白表達，結果顯示，與對照組相比，Si-Hrd1-1組與Si-Hrd1-2組的Hrd1蛋白表達均明顯下降（均P＜0.05）見圖3A，表示Hrd1-SiRNA轉染有效。

無論是經UVA照射還是UVB照射，照射后UV組細胞內Nrf2的表達較對照組下降（UVA照射和 UVB 照射的 t值分別為 13.37、13.67，均 P＜0.05），UV+Si-control組細胞內Nrf2的表達較對照組下降（t分別為 12.38、9.403，均 P＜0.05），UV+Si-Hrd1-1組細胞內Nrf2的表達較UV組明顯升高（t分別為9.263、17.76，均 P＜0.05），UV+Si-Hrd1-2 組細胞內Nrf2的表達較UV組明顯升高（t分別為25.77、25.84，均 P＜0.05）見圖 3B。

2.4 免疫熒光分析 綠色熒光染色的是Hrd1蛋白分子，紅色熒光染色的是Nrf2蛋白分子，二者結合后有橙色熒光出現，表明Hrd1與Nrf2二者在細胞內存在共定位。

2.5 免疫共沉淀 Input為等量的總蛋白；IP-IgG為陰性對照免疫共沉淀；A.IP-Nrf2為Nrf2抗體免疫共沉淀所得蛋白，B.IP-Hrd1為Hrd1抗體免疫共沉淀所得蛋白。

筆者進一步應用免疫共沉淀明確Hrd1與Nrf2在體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞中是否存在內源性結合，結果表明，無論用Nrf2一抗還是Hrd1一抗與體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞總蛋白進行免疫共沉淀，均可證明Hrd1與Nrf2在細胞內存在內源性結合。

3 討論

長期UV照射導致皮膚損傷機制十分復雜，大量研究表明氧化應激是UV造成皮膚損傷的重要原因[11]。Nrf2是一種調節(jié)體內氧化還原平衡的關鍵轉錄因子，以轉錄調控的方式對抗皮膚細胞的氧化應激[12]，正常情況下，Nrf2由細胞質中的細胞骨架相關蛋白Keap1調控，Nrf2和細胞骨架相關蛋白Keap1以N端的Neh2區(qū)域結合成二聚體的形式存在于細胞漿中，從而使保護細胞的酶類和抗氧化物處于基礎表達水平，維持細胞穩(wěn)定狀態(tài)[13]，當細胞受到氧化應激刺激后，Nrf2可與Keap1分離并被轉運到細胞核內，與抗氧化反應原件（Antioxidant response elemen，ARE）結合，啟動Nrf2下游一系列抗氧化酶的合成和表達[14]。Nrf2/ARE信號通路的激活可以保護細胞和組織免受氧化應激的損傷，在UV致皮膚氧化應激的過程中起保護作用[2]。

圖1 免疫組化法檢測人皮膚組織中Hrd1的表達

圖2 Western印跡法檢測紫外線照射對人成纖維細胞中Hrd1和Nrf2表達的影響

圖3 Western blot法檢測人成纖維細胞中下調Hrd1表達對Nrf2表達的影響

圖4 免疫熒光分析法檢測人成纖維細胞中Hrd1和Nrf2的共定位情況

圖5 免疫共沉淀法檢測Hrd1與Nrf2在人成纖維細胞中是否存在內源性結合

激活Nrf2介導的抗氧化損傷通路已被證明可以維持皮膚正常的屏障功能，從而保護皮膚細胞免受UV誘導的損傷。有研究顯示，在同樣UV照射的情況下，Nrf2基因敲除的小鼠與未敲除小鼠相比，前者明顯出現了更強烈的日曬傷和細胞氧化損傷[15]。Nrf2激活劑在防止皮膚光老化中應用廣泛，Nrf2激活劑通過激活Nrf2依賴的基因表達，在應激條件下對皮膚起到保護作用。Patwardhan等[16]研究秋葵提取物對光老化的防護作用及作用機制時發(fā)現，秋葵提取物可通過激活Nrf2通路增加其下游蛋白的表達，使其發(fā)揮下調活性氧簇水平和保持細胞內抗氧化物水平的作用，從而減少UVB照射引起的皮膚成纖維細胞氧化應激。

Hrd1作為內質網相關蛋白降解途經（ERAD）相關E3酶中的一種，在識別、轉運和泛素化折疊錯誤的蛋白的過程中起著重要的作用。在正常生理情況下，Hrd1介導的ERAD可以降解發(fā)生錯誤折疊的蛋白，實現蛋白質量控制的目的。在細胞內質網應激條件下，未折疊蛋白反應（UPR）的感受器IRE1介導的通路可以通過上調Hrd1的表達來清除錯誤折疊蛋白，從而促進細胞存活[17]。在筆者的前期研究中，筆者已發(fā)現UV照射不論在體外還是體內都可以顯著提高皮膚成纖維細胞中Hrd1的表達。

為進一步探究Hrd1與Nrf2之間的關系，本次實驗中，筆者收集12例臨床標本，發(fā)現曝光部位Hrd1的表達水平明顯高于避光部位，且曝光部位人皮膚的Nrf2的表達水平明顯低于避光部位，說明長期進行UV照射會引起皮膚中Hrd1的表達升高以及Nrf2的表達下降。同時，筆者在體外培養(yǎng)人成纖維細胞中進一步驗證了上述結果，無論是UVA還是UVB照射后，與對照組相比，成纖維細胞中Hrd1的表達水平增高，Nrf2的表達水平下降，二者表達呈負相關。

有研究顯示Hrd1是Nrf2的特異性E3泛素連接酶[5，18-19]，Hrd1以Nrf2的Neh4-5結構域為靶點，在氧化應激條件下，Hrd1將Nrf2泛素化和降解，加重細胞的氧化損傷。本次實研究中，筆者利用Hrd1-SiRNA下調成纖維細胞中Hrd1的表達后，可觀察到UV照射引起的Nrf2表達下降可以被逆轉，Nrf2表達水平回升。筆者進一步應用免疫熒光分析和免疫共沉淀實驗來明確Hrd1與Nrf2在細胞內定位和結合情況，免疫熒光分析結果顯示Hrd1和Nrf2在成纖維細胞中均有表達，Hrd1與Nrf2共定位呈現橙色熒光，表明Hrd1與Nrf2在細胞內存在共定位和結合，免疫共沉淀結果同樣也提示Hrd1與Nrf2存在內源性結合，這一結果與Wu等[5]的結果一致，表明Nrf2是Hrd1的特異性結合底物。

綜上，本研究證實了UV照射不論在體內還是體外都可以顯著提高人皮膚成纖維細胞中Hrd1表達，并抑制Nrf2在人皮膚成纖維細胞中的表達，二者表達呈負相關，且Hrd1與Nrf2存在共定位和內源性結合，抑制Hrd1的表達可逆轉UV照射引起的Nrf2表達下降，提示UV照射可通過增加皮膚細胞中Hrd1的表達從而抑制Nrf2的表達，其機制可能與增高的Hrd1加大了對其特異性底物Nrf2的泛素化降解有關，對此筆者還需要進一步的深入研究。