萬夢弟，尤艷

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001）

惡性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）簡稱惡黑，是來源于黑色素細胞、惡性度極高的疾病，其五年生存率從Ⅰ期的95%降至Ⅳ期的不足10%[1]。惡黑已成為皮膚癌致死疾病的首位，其中浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要因素。目前研究表明，MM發(fā)病有多因素、多步驟、逐步變化的特征：由正常上皮黑色素細胞增殖，繼而向真皮層侵襲，最后發(fā)展為MM，其中分子水平的變化是關(guān)鍵[2]研究顯示基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）顯著促進癌細胞的遷移[3]，MMP-2與MMP-9是MMP家族中的重要成員，對癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用。因此，本研究應(yīng)用免疫組化方法觀察MM組織中MMP-2和MMP-9的表達情況以及結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析其陽性表達與患者生存期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 52例MM患者（試驗組）、20例色素痣患者（對照組）標本均來自于2010～2015年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科確診的石蠟包埋組織塊，全部病例術(shù)前均未采取放、化療等任何干預(yù)措施，且全部經(jīng)過皮膚科2位病理醫(yī)師共同確認，所有病例從術(shù)后隨訪至2018年9月1日記錄其生存期，期間患者死亡隨訪停止，收集52例MM患者的生存時間、生存結(jié)局及影響因素（性別、年齡、MMP-2、MMP-9）。試驗組其中男 29 例，女 23 例，年齡25～78歲，平均58歲；對照組男8例，女12例，年齡21～76歲，平均52歲。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體購自武漢博士德公司，SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中山生物公司，石蠟切片機為上海美盛生產(chǎn)的LEICA RM 2125，攝影顯微鏡為日本光學(xué)工業(yè)株式會社生產(chǎn)。

1.3 實驗方法及步驟 免疫組化SP法檢測MMP-2、MMP-9。實驗步驟：石蠟切片脫蠟至水，切片放入緩沖液中微波爐加熱15 min進行抗原熱修復(fù)，加3%H2O2孵育20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加 MMP-2、MMP-9 一抗工作液（工作濃度 1∶100）4℃冰箱過夜，然后按說明書進行DAB顯色，顯微鏡下雙蒸水終止顯色，蘇木素復(fù)染3 min，梯度酒精脫水后樹膠封片，上鏡讀片。

1.4 結(jié)果判斷 MMP-2和MMP-9表達于細胞漿和細胞膜上，隨機選取5個高倍鏡（40×）視野閱片，采用免疫反應(yīng)積分法（Immuno-reactive score，IRS）[4]進行綜合判斷，IRS=陽性細胞百分比積分×陽性細胞染色強度積分，陽性細胞百分比積分標準：根據(jù)顯微鏡下陽性細胞所占百分比積分，未著色0分，1%～10%為 1分，11%～25為 2分，26%～50%為 3分，＞50%為4分；陽性細胞染色強度計分標準：無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。IRS＞4為陽性，≤4為陰性。所有結(jié)果都由2位皮膚病理醫(yī)師雙盲閱片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。MMP-2和MMP-9在MM與色素痣中表達差異采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；性別、年齡、MMP-2和MMP-9在MM表達與預(yù)后關(guān)系采用多變量Cox回歸分析，校正性別、年齡因素后應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制MMP-2與MMP-9生存率曲線，之間的差異應(yīng)用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1A MMP-2在MM組織中的表達

2 結(jié)果

2.1 MMP-2、MMP-9在MM、色素痣中的表達 MMP-2在MM組織中陽性表達率為80.8%（42/52），色素痣為 10%（2/20），二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.440，P＜0.01），見表 1，圖 1A；MMP-9 在 MM 組織中陽性表達率為 76.9%（40/52），色素痣為 15%（3/20），二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.025，P＜0.01），見表 1，圖1B。

2.2 MMP-2和MMP-9在MM中表達率的差異性 MM中組織中MMP-2和MMP-9雙陽性表達為34例，雙陰性為4例，配對四格表資料比較二者在MM中的表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.07，P＞0.05），見表2。

2.3 將性別、年齡、MMP-2、MMP-9進行多變量Cox回歸分析，結(jié)果顯示只進行了MMP-2和MMP-9兩步回歸，說明年齡和性別與MM生存時間無明顯相關(guān)性；MMP-2（B=1.879）、MMP-9（B=1.489）陽性二者的回歸系數(shù) B＞0，MMP-2（HR=6.546，95%置信區(qū)間為 1.543～27.774）、MMP-9（HR=4.434，95%置信區(qū)間為1.623～12.114）蛋白陽性二者的風(fēng)險比HR＞1，說明二者是威脅MM患者死亡的危險因素；在MMP-9表達相同的情況下，MMP-2表達會使MM患者死亡率提高6.564倍；在MMP-9表達相同的情況下，MMP-2表達會使MM患者死亡率提高4.434倍，見表3。

表1 MMP-2、MMP-9在MM及色素痣組織中的表達情況

圖1B MMP-9在MM組織中的表達

表2 MMP-2和MMP-9在MM中表達的差異 例

表3 MMP-2、MMP-9與MM患者預(yù)后的多變量Cox回歸分析

2.4 單因素Kaplan-Meier法分析顯示MMP-2陽性表達的MM患者的生存期顯著低于陰性者（均P=0.004），生存曲線如圖 2A；同樣，MMP-9 陽性表達的MM患者的生存期也顯著低于陰性者（均P＜0.001），生存曲線如圖 2B。

3 討論

MMP-2和MMP-9是2個重要的金屬蛋白酶超家族成員，參與廣泛的蛋白水解事件，包括腫瘤生長，遷移，轉(zhuǎn)移和血管生成。You等[5]研究顯示MMP通過降解細胞外基質(zhì)從而促進MM細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究顯示，在MM組中MMP-2表達率（80.8%）、MMP-9表達率（76.9%）均明顯高于色素痣組（P＜0.01），提示二者在MM病情發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，這與國內(nèi)萬慧穎等[6]研究報道相一致。但導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶高表達的原因尚無明確報道。國外Preisner等[7]的體外研究表明來源于人類脂肪組織的干細胞可使MMP尤其是MMP-2的表達水平增加，但真正在MM患者體內(nèi)有怎樣的分子生物學(xué)變化，現(xiàn)在還不得而知。本實驗結(jié)果顯示MMP-2和MMP-9雙陽性表達的病例數(shù)高達30例（50.69%），應(yīng)用配對四格表資料的χ2檢驗分析其二者在MM中表達的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這不能排除二者之間表達是否有相關(guān)性。Jiang等[8]的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞通過FAK/Akt/ERK和NF-κB信號通路下調(diào)MMP-2/-9的表達。但文獻尚無報道二者在基因及分子水平表達過程中是否有交叉。此外，本研究應(yīng)用多因素逐步Cox相關(guān)分析，排除年齡及性別因素后，發(fā)現(xiàn)MMP-2與MMP-9是影響MM患者預(yù)后的獨立危險因素，而且在MMP-9表達相同的情況下，MMP-2表達會使MM患者死亡率提高6.564倍；在MMP-9表達相同的情況下，MMP-2表達會使MM患者死亡率提高4.434倍。而且單因素分析顯示，MMP-2與MMP-9陽性表達患者的生存期明顯短于陰性者，其表達顯著增加患者死亡風(fēng)險，提示MM患者MMP-2和MMP-9的表達水平在評估患者預(yù)后中可能有潛在價值，有望成為臨床醫(yī)師評估患者預(yù)后的重要指標。本研究樣本量偏小，今后需要更大的數(shù)據(jù)去驗證本次實驗結(jié)果的準確性。另一方面，病例資料全部來源于黑龍江省，因MM發(fā)病有遺傳因素[9]，所以本實驗研究不能排除基因易感性造成的偏倚，而且變量較少，應(yīng)收集更多資料，多因素分析，從而增強預(yù)后評估的準確性。

圖2 MMP-2、MMP-9生存率曲線

通過本次研究，筆者發(fā)現(xiàn)MMP-2及MMP-9在MM組織中高表達，且二者是影響MM患者預(yù)后的獨立危險因素。Ahmad等[10]研究報道了腎癌患者MMP-2、MMP-9血清學(xué)的變化可以用作早期疾病診斷的生物標志物，也可用于監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)。所以下一步計劃應(yīng)用前瞻性研究，收集MM以及色素痣患者術(shù)前、術(shù)后MMP-2、MMP-9血清學(xué)數(shù)據(jù)，分析其用作早期疾病診斷以及監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)的可行性；繼續(xù)深入探究MMP高表達的原因及途徑有望為治療MM提供新的思路及靶點。