胡惠清，李靜，方坤，盧彩紅，劉斌

（武漢市第九醫(yī)院，湖北 武漢438000）

黑色素瘤（Melanoma）是一種來源于黑色素細胞或黑色素前體細胞的惡性腫瘤，常見于皮膚，但也可見于黏膜，是人類皮膚癌中惡性程度最高的腫瘤之一[1]。黑色素瘤惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，預后差[2]。PI3K/Akt/mTOR信號通路廣泛參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡和細胞周期等生理病理活動。該通路在人黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。因此，抑制該通路可能成為治療黑色素瘤的有效手段[3]。最近的研究表明，麥冬有效成分麥冬皂苷B對多種腫瘤細胞增殖有抑制作用[4-5]。本研究以人黑色素瘤細胞系A375為實驗材料，探討麥冬皂苷B抑制黑色素瘤細胞增殖的分子機制，觀察麥冬皂苷B對A375細胞增殖，凋亡和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 麥冬皂苷B粉劑（四川省維克奇生物科技有限公司生產(chǎn)，批號38971-41-4），用二甲亞砜溶解，用改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基稀釋，DMSO終體積分數(shù)≤0.01%；人黑色素瘤細胞A375（中國科學院細胞庫）；100 U/L青霉素和100 μg/L鏈霉素、細胞計數(shù)試劑盒CCK-8（武漢博士德生物公司）；胎牛血清購自Gibco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences公司；β-actin抗體、PI3K 抗體，p-PI3K 抗體，Akt抗體，p-Akt抗體，mTOR 抗體，p-mTOR 抗體、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3、Cyclin D1 抗體購自 CST公司；2抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取人黑色素瘤A375細胞，用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100 mg/L）的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞進行試驗。由健康男性包皮中提取黑色素細胞[6]，在M254培養(yǎng)基（含HMGS）中培養(yǎng)，鈣離子結(jié)合蛋白S100免疫組化染色證實純度超過95%。

1.2.2 CCK-8法檢測麥冬皂苷B對正常黑色素細胞增殖的影響 將對數(shù)生長期正常黑色素細胞消化后，按5×104/孔接種于 96孔板中，培養(yǎng) 24 h，實驗分為只含有培養(yǎng)基和CCK-8的空白組、終濃度分別為 0（溶劑對照組）、5、10、20、40、60 μmol/L 麥冬皂苷B組，每組6孔，培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8 10 μL，待培養(yǎng)液顯色后，用酶標儀測各孔450 nm波長的吸光度A值，以細胞的存活率表示細胞的增殖程度。細胞的存活率（%）=[（A1-A3）/（A2-A3）]×100%。A1：試驗組；A2：對照組；A3：只含有培養(yǎng)基和CCK-8空白組。

1.2.3 CCK-8法檢測麥冬皂苷B對A375細胞增殖的影響 將對數(shù)生長期A375細胞消化后于96孔板中培養(yǎng) 24h，實驗分為 0（對照組）、5、10、20 μmol/L麥冬皂苷B組，各組培養(yǎng)48h后，加入CCK-810μL，待培養(yǎng)液顯色，用酶標儀測各孔450nm波長的A值。

1.2.4 細胞凋亡的檢測 取對數(shù)生長期A375細胞，按5×104/L置于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加細胞懸液2mL，培養(yǎng) 24 h，實驗分為 0（對照組）、5、10、20 μmol/L麥冬皂苷 B組、20 μmol/L麥冬皂苷B+20 mg/L胰島素樣生長因子（IGF）-1，孵育48 h，收集細胞，1 000轉(zhuǎn)/min離心棄上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，收集細胞，在冰浴中避光進行如下操作：用試劑盒中結(jié)合緩沖液懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為5.0×104/L，加入Annexin-FITC和PI染色液，混勻后孵育15min，于1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 流式細胞儀檢測A375細胞周期變化 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度至5.0×104/L，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，實驗分組同方法3，培養(yǎng)48 h，消化，1 000轉(zhuǎn)/min離心，棄上清液，預冷PBS重懸細胞，離心洗滌3次，用體積分數(shù)為70%的乙醇4℃固定過夜。測定前用PBS洗去乙醇，加入含有核糖核酸酶RNase的0.05%PI染色液，避光染色30 min后，上流式細胞儀分析細胞脫氧核糖核酸（DNA）含量的變化。

1.2.6 免疫印跡實驗 實驗分組同1.2.4，細胞經(jīng)不同劑量麥冬皂苷B處理24h后，進行免疫印跡分析。各組細胞經(jīng)PBS洗滌2次后，用預冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，然后4℃12 000轉(zhuǎn)/min離心20 min，收集上清并用BCA法定量。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；再用5%脫脂奶粉封閉過夜，加入Ⅰ抗，室溫孵育3 h后加入Ⅱ抗，最后化學發(fā)光液曝光顯影。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 麥冬皂苷B對正常黑色素細胞增殖的影響 與對照組（麥冬皂苷B濃度0 μg/mL）比較[存活率為（99.08±0.89）%]，5、10、20 μmol/L mg/L 麥冬皂苷 B組[存活率分別為（98.67±0.59）%、（98.43±1.17）%、（98.06±1.06）%]對正常黑色素細胞存活率無明顯影響（F=1.21，P＞0.05）。當麥冬皂苷B濃度為40，60 μmol/L時，比較對照組，細胞存活率顯著下降（F=65.67，P＜0.01），存活率分別為（85.24±3.427）%、（75.33±5.15）%。因此選定麥冬皂苷B的工作濃度為5、10、20μmol/L 。

2.2 麥冬皂苷B對A375細胞增殖的影響 對照組（麥冬皂苷 B 濃度 0 mg/L）和 5、10、20 μmol/L 麥冬皂苷B組細胞存活率分別為（97.34±8.12）%、（69.27±6.78）%、（57.91±6.87）%、（42.70±5.54）%，隨著麥冬皂苷B濃度增加，細胞存活率下降，且呈濃度依賴性，組間差異均有統(tǒng)計學意義（F=67.41，P＜0.01；P＜0.05）。

2.3 麥冬皂苷B抑制了PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化 免疫印跡結(jié)果顯示經(jīng)麥冬皂苷B處理24 h后，細胞內(nèi)PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平受到明顯抑制，且抑制作用呈劑量依賴性（F=40.42，P＜0.01；F=51.23，P＜0.01；F=31.82，P＜0.01）。細胞內(nèi)總 PI3K，Akt，mTOR 的表達量無明顯變化（F=0.72，P＜0.01；F=0.90，P＜0.01；F=0.20，P＜0.01）。但加用 20 mg/L IGF-1處理后，與20 μmol/L麥冬皂苷B組比較，A375細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號通路明顯活化（q=4.52，P＜0.05；q=7.63，P＜0.01；q=3.11，P＜0.05），見圖1。

2.4 麥冬皂苷B通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導A375細胞凋亡和阻滯細胞周期AnnexinV/PI雙染法結(jié)果顯示，用不同濃度麥冬皂苷 B（終濃度分別為 5、10、20 μmol/L）處理 A375 細胞48 h后，細胞總凋亡率分別為（13.39±1.48）%、（24.38±2.44）%、（36.87±2.03）%，與對照組（3.87±0.56）%相比，呈明顯濃度依賴性，組間差異均有統(tǒng)計學意義（F=386.38，P＜0.01；P＜0.05），加用 20 mg/L IGF-1處理后，細胞總凋亡率為（14.63±2.44）%，較20 μmol/L麥冬皂苷 B組明顯降低（q=28.31，P＜0.01）。與對照組相比，5、10、20 μmol/L 麥冬皂苷 B組A375細胞G0/G1期細胞比例差異均有統(tǒng)計學意義（F=56.14，P＜0.01）。對照組細胞 G0/G1期比例低于5 μmol/L麥冬皂苷B組、5 μmol/L麥冬皂苷B組低于10 μmol/L麥冬皂苷B組、10 μmol/L麥冬皂苷B組低于20 μmol/L麥冬皂苷B組，差異有統(tǒng)計學意義（q 值分別為 4.10、3.97、9.45，P＜0.05）。而 IGF-1 處理抑制了麥冬皂苷B的上述效應（q=28.31，P＜0.01）。見圖2。

2.5 麥冬皂苷B通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對凋亡相關(guān)蛋白的影響 經(jīng)Hoechst染色后，對照組中的A375細胞大而飽滿，呈均勻藍色熒光；在麥冬皂苷B處理組中細胞核可見濃染致密的顆粒熒光，細胞縮?。浑S麥冬皂苷B濃度的增加，細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，高倍鏡下可觀察到細胞變小，胞核皺縮、碎裂，染色質(zhì)濃縮，聚集在核膜邊緣，形成染色質(zhì)邊集。見圖3A。

圖1 麥冬皂苷B對A375細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

5、10、20μmol/L麥冬皂苷B組與對照組A375細胞Bcl-2的表達組間差異有統(tǒng)計學意義（F=185.155，P＜0.01），對照組高于 5 μmol/L 組、5 μmol/L 組高于10 μmol/L 組、10 μmol/L 組高于20 μmol/L組（q值分別為 6.7945、14.5883、8.5598，P＜0.05），加用 20 mg/L IGF-1處理后，A375細胞Bcl-2的表達較20 μmol/L麥冬皂苷 B 組明顯降低（q=8.936 85，P＜0.01）；Bax的表達組間差異有統(tǒng)計學意義（F=102.508，P＜0.01），對照組低于 5 μmol/L 組、5 μmol/L 組低于 10 μmol/L組、10 μmol/L 組低于 20 μmol/L組（q值分別為5.177、10.303、7.041，P＜0.05），加用 20 mg/L IGF-1處理后，A375細胞Bax的表達較20 μmol/L麥冬皂苷B組明顯降低（q=20.519 2，P＜0.01）。Cleaved-caspase3 的組間差異有統(tǒng)計學意義（F=131.635，P＜0.01），對照組低于 5 μmol/L 組、5 μmol/L 組低于 10 μmol/L 組、10μmol/L組低于20μmol/L組（q值分別為13.1086、3.999 8、10.654 9，P＜0.05），加用20 mg/L IGF-1 處理后，A375細胞Cleaved-caspase3的表達較20 μmol/L麥冬皂苷 B 組明顯降低（q=23.078 7，P＜0.01）。見圖 3B、C。

3 討論

黑色素瘤的發(fā)病率和死亡率很高，已被證明占皮膚癌死亡例數(shù)的85%以上，在世界范圍內(nèi)造成嚴重的社會經(jīng)濟問題[7]。近年來，惡性黑色素瘤的發(fā)病率一直在上升，年增長率為3%～7%[8]。早期黑色素瘤可通過手術(shù)切除治愈，但轉(zhuǎn)移性黑色素瘤在擴散的情況下可抵抗放療和化療，導致晚期患者的高死亡率。因此，有必要尋找新的治療靶點和策略來有效阻止黑色素瘤的進展和轉(zhuǎn)移。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，多種中藥及其生物活性成分有抗腫瘤作用，是一種新的腫瘤治療策略[9]。幾十年來，麥冬的藥理研究一直廣泛地關(guān)注其在心血管疾病防治中的作用。然而，最近的一項研究表明，麥冬皂苷B是從麥冬中分離出的一種皂苷化合物，能劑量依賴性地提高非小細胞肺癌細胞的增強細胞自噬和凋亡，阻滯細胞周期，有抗腫瘤作用[4]。此外，麥冬皂苷B還可以通過促進JNK1/2和ERK1/2途徑的磷酸化來降低線粒體膜電位和增強活性氧，從而增強SGC-7901人胃癌細胞的凋亡[5]。

圖2 麥冬皂苷B通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導A375細胞凋亡并阻滯細胞周期。

本研究表明，麥冬皂苷B在所選濃度內(nèi)處理正常人黑色素細胞對細胞的增殖無影響，而對A375細胞增殖有明顯抑制作用。隨著促凋亡蛋白的增加和抗凋亡蛋白的減少，麥冬皂苷B劑量依賴性地促進了A375細胞的凋亡。眾所周知，Bcl-2和Bax是參與線粒體依賴性凋亡途徑的2個重要調(diào)控因子，而Caspase-3作為一種關(guān)鍵蛋白酶在細胞凋亡的執(zhí)行階段起著關(guān)鍵作用[10]。在細胞凋亡過程中，凋亡前蛋白Bax在死亡信號的作用下升高，形成Bax/Bax凋亡前同二聚體，這也可以促進細胞色素C的釋放和Caspase-9的活化，從而導致Caspase-3的活化[11-12]。相反，Bcl-2過表達，通過與Bax形成異二聚體發(fā)揮抗凋亡作用，可能中和Bax的促凋亡活性，抑制細胞凋亡[13-15]。此外，筆者的研究顯示麥冬皂苷B通過在G0/G1階段誘導細胞周期停止和阻止細胞進入S階段抑制黑色素瘤細胞的生長。細胞增殖調(diào)控存在2個重要調(diào)控點即G1/S期和G2/M期，當正向調(diào)節(jié)因子積累到越過G1/S期臨界點的濃度水平，細胞就會按照一定的順序完成整個周期，所以G1/S期是細胞周期的重要節(jié)點[16]；Cyclin D1是G1/S調(diào)控點的關(guān)鍵因子之一[17]。麥冬皂苷B處理細胞后，Cyclin D1的表達明顯下降。Chen等[18]結(jié)果表明，不同濃度的OPB能抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，并在G0/G1期引起細胞周期停滯，從而減緩NSCLC NCI-H157和NCI-H460細胞的生長，與本文研究結(jié)果相似。

圖3 麥冬皂苷B通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)A375細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

PI3K/Akt/mTOR信號通路廣泛存在于細胞中，在細胞周期和凋亡中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號途徑在人黑色素瘤中過度活化，提示該通路與人黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3]，mTOR活化并磷酸化4E-BP1，參與形成eIF4F復合物，啟動翻譯并編碼細胞周期調(diào)節(jié)蛋白[19]。本研究發(fā)現(xiàn)麥冬皂苷B可抑制A375細胞中PI3K、Akt、mTOR的磷酸化，抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化，促進人黑色素瘤細胞凋亡，阻滯了細胞周期。當采用PI3K/Akt/mTOR通路激活劑IGF-1處理細胞后，麥冬皂苷B的上述作用被明顯抑制。

總之，麥冬皂苷B能夠誘導促進人黑色素瘤細胞凋亡，阻滯了細胞周期，抑制細胞增殖，本研究為人黑色素瘤的臨床輔助治療提供了新的策略。