鄭清雷 余陳靜 姚坤存 黃 寧 闕友雄,4 凌 輝許莉萍,4,*

甘蔗Rieske Fe/S蛋白前體基因的克隆及表達分析

鄭清雷1余陳靜1姚坤存1黃 寧1闕友雄1,4凌 輝2,3,*許莉萍1,4,*

1福建農林大學/ 農業(yè)農村部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室, 福建福州 350002;2福建農林大學生命科學學院, 福建福州 350002;3玉林師范學院農學院, 廣西玉林 537000;4福建農林大學/ 教育部作物遺傳育種與綜合利用重點實驗室, 福建福州 350002

細胞色素bf復合體還原型鐵硫蛋白前體(Cytochrome bfcomplex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)是由細胞核基因編碼的蛋白, 其成熟蛋白參與構成細胞色素bf復合體, 是電子傳遞的重要元件。基于前期構建的受高粱花葉病毒(, SrMV)侵染的甘蔗轉錄組數據庫, 從主栽甘蔗品種‘新臺糖22號’葉片中成功克隆到該基因, 并命名為(GenBank登錄號為MH333037.1)。生物信息學分析發(fā)現(xiàn),基因cDNA全長824 bp, 包含了一個678 bp的開放閱讀框, 編碼226個氨基酸。ScPetC屬于PRK13473超家族, 其C末端具有典型的Rieske保守結構域; 蛋白理論等電點為8.19, 屬于穩(wěn)定的、親水性蛋白; 二級結構多為無規(guī)則卷曲, 三級結構預測其比其他植物PetC多出一段α螺旋結構。在本氏煙()葉片瞬時表達中, ScPetC定位于葉綠體、細胞質和細胞膜。盡管前人研究表明,的表達量會受SrMV侵染的影響, 不同于半夏() PetC與大豆花葉病毒(, SMV) P1蛋白之間的互作, ScPetC不能與SrMV-P1蛋白互作, 但能與甘蔗黃葉病毒(, SCYLV) P0蛋白互作。實時熒光定量PCR分析表明,基因在甘蔗不同組織中均有表達, 但在葉片中的表達量最高。甘蔗受脫落酸脅迫3 h時,表達量顯著上調, 但是隨著處理時間的延長, 表達受到抑制; 在茉莉酸甲酯、水楊酸、氯化銅、氯化鎘和氯化鈉脅迫下,表達量均顯著下調。本研究通過對ScPetC生物學功能、環(huán)境外源激素與重金屬等脅迫下的表達模式及其與甘蔗病原病毒蛋白互作的初步探究, 增加了對甘蔗PetC的了解, 也為深入研究其在甘蔗受黃葉病毒侵染中的作用奠定基礎。

甘蔗; 細胞色素bf復合體還原型鐵硫蛋白前體; 生物信息學; 亞細胞定位; 蛋白互作; 實時熒光定量PCR

甘蔗(spp. hybrids)是最重要的糖料作物和重要的能源作物[1]。甘蔗花葉病和黃葉病是甘蔗生產上最主要的2種病毒性病害, 嚴重影響甘蔗產量[2-4]。感染花葉病的甘蔗葉片會出現(xiàn)黃綠相間的嵌紋、條斑等癥狀, 嚴重時導致葉片失綠[2]。高粱花葉病毒(, SrMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬(), 是引起甘蔗花葉的主要原因之一[5]。甘蔗黃葉病毒(, SCYLV)屬馬鈴薯卷葉病毒屬(), 甘蔗感染后也會出現(xiàn)失綠癥狀[3], 但其典型癥狀是葉片的中脈發(fā)黃[3]。研究這2種病毒與宿主甘蔗基因的互作機制對甘蔗抗病育種具有重要意義。

一般而言, 植物RNA病毒的基因組具有多個開放讀碼框(open reading frame, ORF), 它們編碼的蛋白控制著病毒侵染植物過程中的不同機制, 但不同的病毒之間也存在一些功能相似的蛋白。P1和P0蛋白分別是SrMV和SCYLV基因編碼的首個蛋白, 并且都參與病毒—寄主互作以及病毒抑制宿主免疫反應[6-11]。前人通過對馬鈴薯Y病毒屬的李痘病毒(, PPV) P1蛋白進行研究, 發(fā)現(xiàn)此蛋白并沒有直接的沉默抑制效應, 但可以通過自身剪切, 與HC-Pro配合行使沉默抑制功能[8-9]; 同屬的黃瓜脈黃病毒 (, CVYV) P1蛋白中的P1a前導蛋白對控制病毒特異性識別寄主具有重要作用[8]。在對植物致病方面, 當從PPV基因組中移除編碼P1蛋白的區(qū)域后, 受PPV侵染的本氏煙()葉片壞死和萎縮癥狀加深[9]; 相反地, 當馬鈴薯卷葉病毒屬的甘蔗黃葉病毒P0蛋白缺失N端的15個氨基酸后, 該蛋白則會丟失對植物的致病性[10]。另外, 也有報道稱其同屬的甜菜西黃病毒(, BWYV) P0區(qū)域能轉錄出一個參與病毒和寄主相互識別作用的蛋白[11]。

葉綠體是高等植物進行光合作用的場所。一方面, 對植物的生長發(fā)育起著重要作用; 另一方面, 也成為自身健康生長的隱患[12-13]。當植物感染病毒后, 會利用葉綠體進行復制擴繁, 破壞葉綠體相關的結構原件, 影響光系統(tǒng)、電子傳遞鏈等過程, 最終影響植物正常生長[13]。截至目前, 已經發(fā)現(xiàn)多個植物葉綠體蛋白會同病毒蛋白互作并參與病毒侵染過程, 洋蔥1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基(Rubisco large subunit, RbcL)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(Rubisco small subunit, RbcS)都能與馬鈴薯Y病毒屬的青蔥黃條病毒 (, SYSV)、蕪菁花葉病毒(, TuMV)、大豆花葉病毒(, SMV) P3蛋白互作, 參與葉片失綠癥狀的形成[14]。甘蔗花葉病毒(, SCMV)的VPg會和甘蔗NAD(P)H脫氫酶復合體O亞基在葉綠體內發(fā)生互作, 阻礙電子循環(huán), 影響葉綠體的形成, 最終導致花葉病癥[15]。半夏()中的細胞色素bf復合體還原型鐵硫蛋白前體(Cytochrome bfcomplex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)會和大豆花葉病毒(, SMV)P1蛋白發(fā)生互作, 引起寄主對病毒的適應性改變[16]。在馬鈴薯卷葉病毒屬病毒蛋白的研究中, 擬南芥S-相激酶相關蛋白(S-phase kinaserelated protein 1, AtASK1)能與甜菜西黃病毒(, BWYV)、南瓜蚜傳黃化病毒(, CABYV)的P0蛋白發(fā)生互作, 降低植物對病毒的抵抗能力; 敲除本氏煙草內擬南芥同源基因后, 感病本氏煙恢復對病毒的抵抗; 同時, 在突變P0氨基酸序列中最保守的F基序后, P0丟失了沉默抑制功能, 并且不再與AtASK1互作[17]。本氏煙草1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基裝配因子2 (Rubisco Assembly Factor 2, RAF2)會與蕓薹黃化病毒(, BrYV)的P0蛋白互作, 并協(xié)助病毒進行侵染[18]。

植物的光合電子鏈主要由PSII (光反應系統(tǒng)II)、質體醌(plastoquinone, PQ)、細胞色素bf復合體(cytochromebfcomplex, Cytbf)、質藍素(plastocyanin, PC)、PSI (光反應系統(tǒng)I)和鐵氧還原蛋白組成; 電子傳遞方式主要分為非環(huán)式電子傳遞、環(huán)式電子傳遞和假環(huán)式傳遞3種。在這3種電子傳遞過程中, Cytbf皆有參與[19]。Cytbf復合體包含4個大亞基 (細胞色素、細胞色素b、Fe/S蛋白和亞基IV)和4個小亞基 (PetG、PetI、PetM和PetN)[20]。自從Rieske等人在線粒體細胞色素bc中發(fā)現(xiàn)大量攜帶有[2Fe-2S]結合域的蛋白之后, 這類蛋白就被大家稱為Rieske蛋白[21-22]。現(xiàn)已從菠菜()[23]、豌豆()[24]等植物細胞色素bf復合體中分離到Rieske Fe/S蛋白, 并且了解到該蛋白是由細胞核基因編碼[25], 在細胞質基質中合成蛋白前體, 由N端信號肽引導至葉綠體基質, 后被加工成成熟蛋白, 結合到類囊體膜上[26-27], 與細胞色素、細胞色素b和亞基IV共同裝配成葉綠體細胞色素bf復合體, 參與光合電子傳遞過程[28-30]。在轉入基因的水稻()[31]和擬南芥()[32]的試驗中發(fā)現(xiàn), PetC成熟蛋白在葉片內富集會提高光合系統(tǒng)電子傳遞量, 從而提高產量。西瓜在強光干旱脅迫下通過轉變PetC蛋白翻譯后修飾模式, 穩(wěn)定此蛋白的表達量, 維持電子傳遞量, 進而緩解脅迫對植物的危害[33]。

時至今日, 越來越多植物中編碼PetC的基因被克隆出來[31-34], 并發(fā)現(xiàn)它會響應強光[33]、模擬干旱[34]等非生物脅迫。不僅如此, 植物在響應生物脅迫方面也有報道, 在感染了白粉病菌()的小麥()表達序列標簽(Expressed Sequence Tags, EST)的表達文庫中, 編碼PetC的基因出現(xiàn)了差異表達[35]。課題組[36]前期在黑穗病菌()侵染甘蔗黑穗病易感與抗性品種后, 質譜分析結果顯示, 甘蔗高感品種Ya71-374中PetC相對于高抗品種NCo376中的表達量增加。Ling等[37]利用RNA定量的方法對感染SrMV甘蔗葉片進行分析, 結果顯示在抗性品種YZ01-1314中下調表達, 在易感品種ROC22、FN40中上調表達。雖然編碼ScPetC成熟蛋白的序列已經被克隆出來并被命名為[34], 但與此不同的是, 本研究中克隆到的是甘蔗細胞色素bf復合體鐵硫亞基蛋白前體基因。通過在本氏煙葉片進行瞬時表達, 我們觀察了ScPetC亞細胞定位情況, 并利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗, 驗證該蛋白與SrMV-P1蛋白、SCYLV-P0蛋白的互作情況, 研究結果對深入了解PetC如何參與病毒引起甘蔗葉片變黃癥狀奠定一定的理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和處理方法

供試甘蔗基因型為我國主栽品種新臺糖22號, 由福建農林大學農業(yè)農村部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室提供。

RT-PCR克隆材料: 取植株的+1葉(第1片可見肥厚帶的葉片), 用錫紙包好, 液氮速凍, 保存于-80℃冰箱。

組織特異性分析材料: 參照黃寧等[38]方法, 從田間選取健康長勢一致的植株9株, 清理根部泥土, 取白色幼根作為材料; 從地面以上可見完整第1節(jié)間算起, 選取第7~8節(jié)段, 用75%酒精擦拭表皮, 從側芽、蔗皮、蔗髓取樣; 葉片選取甘蔗+1葉。以上樣品均選擇3株混合作為一個重復, 共3個生物學重復, 用錫箔紙包好所有材料, 立刻投入液氮速凍, 保存于-80℃冰箱。

不同外源脅迫處理材料: 考慮到植物會釋放內源激素來抵抗病毒的侵染[13], 因此我們用不同外源脅迫處理甘蔗的方法來模擬病毒侵染。參照蘇亞春等[39]方法, 在田間隨機選取長勢一致的植株, 將其蔗莖砍成單芽莖段、洗凈, 放在含有100 mg L-1多菌靈(福瑞得, 中國鄭州)水溶液中進行52℃溫浴脫毒30 min, 然后將這些莖段種在無菌土中(16 h光/ 8 h暗, 28℃)培養(yǎng), 直至長出蔗苗, 切下蔗苗用于無菌苗的誘導生根。隨后放入蒸餾水中培養(yǎng)一段時間待其生長穩(wěn)定, 從中挑選一部分健壯且長勢一致的蔗苗, 置于250 mmol L-1氯化鈉(sodium chloride, NaCl)、100 mmol L-1氯化銅(copper chloride, CuCl2)、500 mmol L-1氯化鎘(cadmium chloride, CdCl2)的水溶液中培養(yǎng), 并于0、6、12、24 h取樣; 取另一部分蔗苗在100 μmol L-1脫落酸(abscisic acid, ABA)、5 mmol L-1水楊酸 (salicylic acid, SA) (含0.01%吐溫-20, v/v)和25 mmol L-1茉莉酸甲酯(methyl jasmine, MeJA)(含0.01%吐溫-20, v/v)水溶液中培養(yǎng), 并于0、3、6、12 h取樣, 每個處理選擇3株混合作為1個重復, 共取3個生物學重復。每個樣品取樣完成、液氮速凍, 保存于-80℃冰箱。

1.2 RNA提取與cDNA的合成

采用TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, USA)試劑提取所有甘蔗樣品的總RNA, 提取方法參照Liu等[40], cDNA第一鏈合成方法參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Lithuania, Vilnius)和PrimerScript RT-PCR Kit (Takara, 中國大連)試劑盒說明書。

1.3 甘蔗ScPetC基因序列獲取與RT-PCR克隆

基于課題組構建的感染SrMV葉片的甘蔗轉錄組uingene注釋庫, 挖掘得到基因unigene序列(轉錄本ID: T2_Unigene_BMK.38583), 并根據其序列設計克隆特異性引物-F/R (表1), 以甘蔗葉片cDNA為模板, 進行PCR擴增。PCR擴增程序為94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 60 s, 40個循環(huán); 72℃ 10 min; 隨后進行回收、純化、測序與鑒定。

1.4 生物信息學分析

利用ExPaSy、Prabi、SWISSMODEL在線軟件, 對ScPetC進行一、二、三級結構預測, 使用NCBI conserved domains、SignalP 4.1 Server、TMHMM 2.0 Server、ProtScale和WoLFPSORT, 分別進行保守結構域、信號肽、跨膜結構域、疏水性和亞細胞定位預測, 在線軟件網址如表2所示。使用DNAMAN 6.0將基因編碼的氨基酸序列與NCBI下載的來自其他植物的PetC的氨基酸進行多序列比對。參考Schmidt等[41]的方法, 使用MEGA 6.0軟件對ScPetC、其他高等植物PetC和細胞色素bcRieske Fe/S蛋白、藍藻細菌細胞色素bfRieske Fe/S蛋白和細菌細胞色素Rieske Fe/S蛋白進行進化樹構建。通過MEME對植物氨基酸進行motif (基序)預測, 在Adobe Photoshop CS6上進行圖片美化。

表1 引物序列及用途

表2 生物信息學研究的數據庫和軟件

1.5 酵母雙雜交實驗

以pMD19-、pMD19-、pMD19-(課題組前期實驗獲得)質粒為模板, 以-AD-F/R、-BK-F/R、-BK-F/ R (表1)為引物, 通過PCR、膠回收獲得基因編碼序列。隨后使用ClonExpress II One Step Cloning Kit (諾唯贊, 中國南京)同源重組的方法, 將基因編碼序列導入經過限制性內切酶RI和HI (Thermo Scientific, Lithuania, Vilnius)雙酶切的pGADT7、pGBKT7載體中, 構建載體pGADT7-pGBKT7、pGBKT7-。測序正確的陽性質粒以共轉化方式導入酵母Y2HGold感受態(tài)細胞(上海維地, 中國上海)。實驗參照Matchmaker Gold酵母雙雜交系統(tǒng)說明書, 在SDO (SD/-Trp)固體培養(yǎng)基上進行毒性驗證, 在SDO (SD/-Trp/X-α-Gal/AbA)固體培養(yǎng)基上進行自激活驗證, 在QDO (SD/-Ade/-His/ Leu/-Trp/X-α-Gal)和QDO/X/A (SD/-Ade/-His/Leu/- Trp/X-α-Gal/AbA)固體培養(yǎng)基上進行互作驗證。

1.6 植物表達載體構建

以攜帶有、、基因的相關質粒為模板, 用引物-YN-F/R、- YC-F/R、-YC-F/R (表1)進行PCR、膠回收獲得基因編碼序列。隨后使用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重組的方法, 將基因編碼序列導入經過限制性內切酶I和I、I和I雙酶切的pCAMBIA1300S-YN、pCAMBIA2300S- YC[42]載體中, 構建載體pCAMBIA1300S-YN-、pCAMBIA2300S-YC-、pCAMBIA2300S- YC-用于雙分子熒光互補試驗 (Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC)。

以pMD19-T-陽性質粒為模板, 使用引物-Subloc-F/R (表1)進行PCR、膠回收獲得基因編碼序列。隨后使用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重組的方法, 將基因編碼序列導入經過限制性內切酶I和HI雙酶切的pCAMBIA2300-YFP載體中, 構建載體pCAMBIA2300--YFP用于蛋白亞細胞定位實驗。

1.7 本氏煙草葉片注射與熒光觀察

將pCAMBIA1300S-YN-、pCAMBIA 2300S-YC、pCAMBIA2300S-YC-和pCAMBIA 2300--YFP轉化農桿菌菌株GV3101 (上海唯地, 中國上海), 在含有35 μg mL-1利福平和50 μg mL-1卡納霉素的YPD液體培養(yǎng)基中擴繁后, 收集農桿菌菌體, 用MS鹽緩沖液懸浮, 并將菌體懸浮液OD600調至0.8。加入乙酰丁香酮(工作濃度200 μmol L-1), 28℃避光誘導培養(yǎng)2 h, 隨后注射本氏煙葉片下表皮, 于48 h后在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8, 曼海姆, 德國)下拍攝YFP熒光(激發(fā)光波長514 nm, 捕獲波長為530~590 nm)、葉綠體自發(fā)熒光(激發(fā)光波長552 nm, 捕獲波長為650~680 nm)。

1.8 實時熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)分析

根據基因序列設計特異性定量引物-QF/QR (表1), 以clathrin adaptor complex ()和cullin ()作為內參基因[43]。參照SYBR Green PCR Master Mix (Roche, 中國上海)試劑盒說明書配制定量反應體系, 進行定量PCR, 以檢測目的基因在甘蔗的不同組織(根、芽、葉、蔗髓和蔗皮)和不同外源脅迫(SA、MeJA、ABA、NaCl、CuCl2和CdCl2)處理樣品中的相對表達量。定量PCR程序為50℃ 2 min; 95℃預變性10 min, 95℃變性15 s, 60℃退火延伸1 min, 40個循環(huán); 增加熔解曲線, 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 95℃ 15 s, 60℃ 15 s。每個樣品設3次技術重復和3次生物學重復, 陰性對照以無菌水為模板, 定量數據采用2–DDCT法計算基因相對表達量。使用DPS 7.05對數據進行顯著性分析, Original 8.0軟件做柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 甘蔗ScPetC基因克隆及生物信息學分析

采用基于SrMV侵染甘蔗的轉錄組數據庫基因Unigene序列設計擴增引物, 以葉片cDNA為模板, 擴增得到一條長824 bp的片段 (圖1-A)。擴增產物經過連接、轉化、測序, 獲得基因序列。經過ORF Finder在線分析,基因的完整開放讀碼框為678 bp, 編碼225個氨基酸。與基因(GenBank登錄號為JQ712582)進行序列比對發(fā)現(xiàn), 核酸相似度達到73.87%,在5￠端比多129個堿基, 在3￠端比少了97個堿基, 但不影響蛋白編碼。氨基酸比對結果顯示, 2條基因編碼的氨基酸序列相似度為84.44% (圖1-B), 經過進一步的分析, ScPetC氨基酸鏈的N端比SoCYT多出33個氨基酸殘基, 并且2條鏈中的第47個(丙氨酸A~纈氨酸V)、第70個(絲氨酸S~甘氨酸G)氨基酸不同。綜上結果表明, 克隆自現(xiàn)代雜交種的與成熟蛋白基因的編碼序列和蛋白序列高度保守, 僅存在個別位點的差異。

圖1 甘蔗ScPetC基因的RT-PCR擴增及其編碼氨基酸序列

(A) M: marker 100 bp; I: RT-PCR產物。(B): 甘蔗細胞色素bf復合體還原型鐵硫蛋白前體序列;: 甘蔗細胞色素bf復合體鐵硫亞基氨基酸序列[34]。

(A) M: DNA marker 100 bp; I: RT-PCR product. (B): Sugarcane cytochromebfcomplex reduced iron-sulfur protein precursor sequence;: Sugarcane cytochromebfcomplex iron-sulfur subunit amino acid sequence[34].

利用ExPaSy在線軟件對ScPetC一級結構進行預測, 結果顯示該蛋白分子式為C1054H1668N294O315S11, 相對分子量為23.85 kD, 疏水性平均值為-0.146, 蛋白不穩(wěn)定系數為21.61, 等電點為8.19 (表3)。蛋白不穩(wěn)定系數小于40, 等電點大于7.5, 表明該蛋白為穩(wěn)定的堿性蛋白; 通過SignaIP 4.1 server、TMHMM 2.0 Server和NCBI conserved domains軟件對ScPetC結構域或基序進行預測, 結果表明該蛋白無信號肽(圖2-A), 為非分泌蛋白, 并且在第66個到第88個氨基酸之間存在一個跨膜區(qū)域(圖2-B), 屬于PRK13474超家族(圖2-C)。因此推測ScPetC是一個堿性穩(wěn)定親水非分泌蛋白。

表3 ScPetC一級結構預測分析

圖2 甘蔗ScPetC的生物信息學軟件預測結果

A: 信號肽; B: 跨膜結構域; C: 保守結構域。

A: signal peptide; B: transmembrane domain; C: conservative domain.

ScPetC的二級結構預測結果顯示, α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲的氨基酸殘基數分別為42、49和134個, 占比分別為18.67%、21.78%和59.56%。

根據SWISSMODEL三維結構預測, 比較甘蔗與單子葉植物水稻、雙子葉植物半夏和菠菜PetC三維空間結構 (圖3), 甘蔗ScPetC構象與其他3種植物空間構象基本相似, 都具有N末端α螺旋結構和[2Fe-2S]結合域, 但甘蔗該蛋白的構象中多出了一個α螺旋結構(圖3-A)。

圖3甘蔗、水稻、半夏和菠菜的PetC成熟蛋白三級結構預測

黃色箭頭處為PetC蛋白的[2Fe-2S]結合域; 藍色和紅色箭頭所指位點為氨基酸鏈的N端和C端; 綠色箭頭所指位點為α螺旋。圖A中白色箭頭表示ScPetC與其他植物PetC的差異α螺旋所在位置。

Yellow arrow is the conservative binding domain [2Fe-2S] of PetC; blue and red arrows represent the N-terminus and C-terminus of the amino acid chain; green arrows represent α helix. White arrow represents the α helix in sugarcane that is different from other plants of tertiary structure in figure A.

根據WoLFPSORT對ScPetC氨基酸序列的掃描結果, 了解到該蛋白定位于甘蔗細胞的亞細胞結構中的可能性由大到小, 分別為葉綠體類囊體(65.7%)、線粒體(15.38%)、細胞質(13.29%)、細胞核(11.59%)、液泡(11.01%)和葉綠體基質(8.95%)。因此, 本研究推測ScPetC最有可能定位于葉綠體類囊體。

2.2 甘蔗ScPetC的保守結構域及系統(tǒng)進化

對比甘蔗與其他植物PetC氨基酸序列(圖4), 發(fā)現(xiàn)甘蔗與高粱()、水稻、半夏、本氏煙、菠菜和豌豆的PetC序列相似度分別是97.35%、84.14%、70.74%、68.87%、66.95%和64.38%。這7種植物的PetC序列中均含有N末端的轉移多肽區(qū)域、跨膜α螺旋區(qū)域、結合[2Fe-2S]的Rieske區(qū)域和靠近C末端的脯氨酸環(huán)區(qū)域(圖4)。

將甘蔗與27個其他物種PetC的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹(圖5)。結果顯示, 所有物種的PetC可以被劃分為細胞色素bc復合體和細胞色素bf復合體2個亞類。在細胞色素bf復合體亞類中, 不同物種的PetC可以被分為5組(I、II、III、IV、V), 其中甘蔗與高粱的PetC聚為一個分支, 表明其親緣關系較近。細胞色素bc復合體亞類中, 不同物種的PetC可以被分為2組(VI、VII)。MEME軟件預測結果顯示, ScPetC和其他高等植物細胞色素bf復合體PetC一樣具有6個motif。綜上, 本研究推測ScPetC也可能與其他植物PetC具有相似的功能。

圖4 甘蔗ScPetC與其他植物PetC氨基酸序列對比

紅色方框表示ScPetC內為已報道保守氨基酸基序。CAM57108: 半夏; XP_015647138: 水稻; XP_002441121: 高粱; P08980: 菠菜; P26291: 豌豆; CAA45705: 本氏煙。

Red squares indicate the reported conserved motif of amino acid regions within the ScPetC. CAM57108:; XP_015647138:; XP_002441121:; P08980:; P26291:; CAA45705:.

2.3 甘蔗ScPetC的亞細胞定位

由圖6可知, 對照組中YFP黃色熒光信號在本氏煙葉表皮細胞的細胞膜、細胞核和細胞質均有分布; ScPetC-YFP融合蛋白的黃色熒光信號既定位于質膜、細胞質, 又與葉綠體的自熒光信號重合, 顯示出橙色, 表明ScPetC定位于葉綠體(圖6)。

2.4 甘蔗ScPetC與病毒蛋白的互作

酵母雙雜交互作實驗中, 分別導入以下質粒組合pGADT7-T+pGBKT7-Lam、pGADT7-T+pGBKT7- 53、pGADT7-+pGBKT7-、pGADT7-+ pGBKT7-、pGADT7-+pGBKT7、pGADT7+ pGBKT7-、pGADT7+pGBKT7-到Y2Hgolden菌株中, 它們均能在DDO (SD/-Leu/-Trp)固體培養(yǎng)基上正常生長, 說明質粒組合成功轉入酵母感受細胞。同時, 在QDO (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal)和QDO/X/A (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)固體培養(yǎng)基上, 陽性對照能正常生長并在加入X-α-Gal后表現(xiàn)出藍色, 陰性對照不能正常生長, pGADT7+pGBKT7-不能在酵母缺陷培養(yǎng)基上生長(圖7-A), 而pGADT7-+pGBKT7-能在缺陷培養(yǎng)基上生長并且在加入X-α-Gal后成功顯色, 說明ScPetC與SrMV-P1蛋白不存在互作, 與SCYLV-P0蛋白存在互作(圖7-B)。

為進一步驗證互作結果, 本研究將基因構入pCAMBIA1300S-YN載體, 形成YN-ScPetC; SCYLV-P0基因構入pCAMBIA2300S-YC載體, 形成YC-P0; 結果在注射YN-ScPetC和YC-P0的本氏煙葉片細胞內出現(xiàn)了黃色熒光(圖7-C)。酵母互作和雙分子熒光互補實驗的結果一致, 說明ScPetC和SCYLV-P0確實存在互作。

圖5 甘蔗ScPetC與其他物種PetC的系統(tǒng)進化樹分析與motif預測

圖中進化樹橘色部分代表細胞色素bf復合體類, 藍色部分代表細胞色素bc復合體類; III組中的紅色圓圈標記為ScPetC; 不同顏色的方框代表不同的組(I、II、III、IV、V、VI、VII)。NP_001237648.2: 大豆; XP_015647138.1: 水稻; XP_0202013301.1: 小麥; Q9ZR03.1: 擬南芥; P26291: 豌豆; AAD55565.1: 團藻; CAA27194: 類紅球細菌; CAA45705: 本氏煙; CAA70823: 席藻; CAB72244: 魚腥藻; CAM57108.1: 半夏; CAM57109.1: 馬蹄蓮; O49078: 貝母; P05417: 脫氮副球菌; P08067: 釀酒酵母; P08980: 菠菜; P14698: 藍藻; P23136: 深紅紅螺菌; P26290: 集胞藻; P26291: 豌豆; P26292: 聚球藻; P37841: 馬鈴薯; P49728: 衣藻; Q9ZR03: 擬南芥; XP_002441121: 高粱; ACG28308: 玉米; XP_004951312: 小米。

The orange part of the phylogenetic tree represents the cytochromebfcomplex cluster, the blue part represents the cytochrome bccomplex cluster; the red cycle is labeled as ScPetC; the different color boxes in the figure represent different groups (I, II, III, IV, V, VI, VII). NP_001237648.2:; XP_015647138.1:; XP_0202013301.1:; Q9ZR03.1:; P26291:; AAD55565.1:; CAA27194:; CAA45705:; CAA70823:; CAB72244:; CAM57108.1:; CAM57109.1:; O49078:; P05417:; P08067:; P08980:; P14698:spPCC; P23136:; P26290:sp.PCC; P26291:; P26292:sp. PCC; P37841:; P49728:; Q9ZR03:; XP_002441121:; ACG28308:; XP_004951312:. motif 1: X6NAXCTHLGCVVPX3ENKFXCPCHGSX10GPAP; motif 2: NLX11PDX3RX3NLX22PX3GX3GXXAKGXXGNDX6LX7LXXGLKGDPTYX2V; motif 3: X7WXETDFRTX3PWW; motif 4: XGDX3GWFCPCHGSHYDX2GRIRXGPAPXNLX15; motif 5: X7MX4DX2AX5VX7GX6WXGKPVFXRXRX4IX5VX4LXDX10; motif 6: X2AXSIX ADXV; motif 7: XWLX3GXCTHLGCX; motif 8: X9QLX10; motif 9: LVVEXDXT; motif 10: FX5FX3DDSSX2RSXSPSLXSXFLX3RGFS SNSVSPAHX2GLVXDLPXTVAAIKNPXSKIVYDX2NHERYPPGDPSKRAFAYFVLTGGRFVY.

(圖6)

農桿菌介導及空載體在本氏煙葉片瞬時表達48 h后的亞細胞定位結果; 本氏煙葉片表皮細胞被用于明場、黃色熒光、葉綠體自發(fā)熒光、明場和黃色及紅色熒光疊加后的圖像分析; 藍色箭頭1、2分別表示細胞核、質膜; 紅色虛線框表示被放大區(qū)域; 比例尺=50 μm; 35S::YFP: 攜帶空載pCAMBIA2300-YFP的農桿菌菌株; 35S:: ScPetC::YFP: 攜帶重組載體pCAMBIA2300--YFP的農桿菌菌株。

Subcellular localizations of themediated transformation ofand empty vector inleaves after 48 h infiltration; the epidermal cells ofwere used for taking images of visible light, yellow fluorescence, chloroplast autofluorescence, and merged visible light. Blue arrows 1 and 2 indicate nucleus and plasma membrane. The area in the red rectangle is magnified. Bar=50mm; 35S::YFP: thestrain carrying the empty vector pCAMBIA2300-YFP; 35S:: ScPetC::YFP: thestrain carrying the recombinant vector pCAMBIA2300--YFP.

圖7 甘蔗ScPetC與高粱花葉病毒和甘蔗黃葉病毒蛋白的互作實驗驗證

A: 甘蔗ScPetC與SrMV-P1蛋白的酵母雙雜交互作驗證。B: 甘蔗ScPetC與SCYLV-P0蛋白的酵母雙雜交互作驗證; SD/-Ade/-His/Leu/-Trp: 腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基; SD/-Ade/-His/Leu/-Trp/X-α-Gal: 腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基(添加5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷); SD/-Ade/-His/Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA: 腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基(添加5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷和金擔子素A)。C: ScPetC與SCYLV-P0蛋白的雙分子熒光互補實驗; YC、YN、YN-ScPetC和YC-P0分別代表質粒pCAMBIA2300S-YC、pCAMBIA2300S-YN、pCAMBIA2300S-YN-和pCAMBIA2300S-YC-[42]。

A: ScPetC was verified by yeast double-hybrid interaction with SrMV-P1 protein. B: ScPetC was verified by yeast double-hybrid interaction with SCYLV-P0 protein; SD/-Ade/-His/Leu/-Trp: synthetic dropout medium plate without adenine, histidine, leucine, tryptophan; SD/-Ade/-His/Leu/-Trp/X-α-Gal: synthetic dropout medium plate without adenine, histidine, leucine, tryptophan (plus 5-bromo-4-chloro-3- indoxyl-α-D-galactopyranoside); SD/-Ade/-His/Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA: synthetic dropout medium plate without adenine, histidine, leucine, tryptophan (plus 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside and aureobasidin A). C: the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay of the interaction between ScPetC andSCYLV-P0 protein; YC, YN, YN-ScPetC, YC-P0 represent the plasmids pCAMBIA2300S-YC, pCAMBIA2300S-YN, pCAMBIA2300S-YN-, pCAMBIA2300S-YC-, respectively[42].

2.5 甘蔗ScPetC基因的轉錄表達模式分析

由圖8-A可知,基因在甘蔗葉片中的表達量最高, 其次是蔗皮、蔗芽和蔗髓, 在根中幾乎不表達。分析結果顯示, 該基因在葉片中的表達量分別是蔗髓、蔗芽、蔗皮和根部表達量的15、15、4和174倍, 說明該基因在葉綠體和線粒體豐富的細胞中均有表達。

分析基因在不同外源脅迫下的表達特性, 結果表明在對甘蔗施以CuCl2、CdCl2和NaCl處理后,的表達量下降并顯著低于對照(圖8-B); 用SA、MeJA處理甘蔗后,表達量隨著施用時間延長, 持續(xù)下降; 甘蔗在受ABA處理3 h后,的表達量顯著提高并達到峰值, 為對照組的1.3倍, 當處理時間達到6 h時, 表達量下降但仍高于對照, 處理達到12 h時, 表達量下降并顯著低于對照(圖8-C)。我們推測該基因可以在短時間內積極響應ABA的脅迫。

圖8 甘蔗ScPetC基因的轉錄表達模式分析

A: 甘蔗基因在甘蔗不同組織中的表達情況; B和C: 甘蔗基因在不同外源脅迫下的相對表達情況。不同的小寫字母(a、b、c、d)表示差異顯著性(≤ 0.05); 誤差線為每組處理的標準誤差(= 3)。

A: the tissure-specific expression analysis ofgene in sugarcane; B and C: relative expression ofin sugarcane under different exogenous stresses. Bars with different superscripts (a, b, c, d) represent differ significantly (≤ 0.05) and error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

3 討論

植物受到病毒侵染時, 會通過改變體內相關基因的表達量來抵抗病毒侵染。葉綠體作為植物重要的細胞器, 其中的基因與蛋白也會參與到病毒抵御過程[13]。到目前為止, 已經發(fā)現(xiàn)多個葉綠體蛋白能參與到病毒的復制、移動、致病等過程中[13]。ScPetC成熟蛋白是植物細胞色素bf復合體的元件之一, 在葉綠體光合電子轉運過程中起重要的作用[20], 但是關于植物ScPetC與病毒蛋白互作研究仍比較少見, 截至目前只有兩例, 一例是半夏PetC與馬鈴薯Y病毒屬SMV-P1蛋白互作[16]; 另一例是擬南芥PetC與馬鈴薯Y病毒屬TuMV-HC-Pro蛋白互作[44]。本研究是首次報道ScPetC與馬鈴薯卷葉病毒屬SCYLV- P0蛋白互作。

ScPetC屬于PRK13474超家族, 包含由半胱氨酸和組氨酸組成的(CTHXXC, CPCHXX) Rieske結構域 (圖4)。這個結構域位于氨基酸鏈的C端附近, 是Rieske家族蛋白主要特征[41]。高等植物Rieske蛋白主要被分為兩類, 分別是細胞色素bf復合體類和細胞色素bc復合體類。本研究中ScPetC屬于細胞色素bf復合體類, 其N端存在一個由33個氨基酸組成的區(qū)域, 在梁潘霞等[34]克隆到的基因編碼氨基酸鏈中并不存在。通過與其他植物PetC氨基酸序列比對后, 認識到這段氨基酸是轉移多肽區(qū)域, 其中的保守序列與前人研究結果相一致[23-24], 因此我們確定克隆到的是甘蔗葉綠體細胞色素bf復合體Rieske Fe/S蛋白前體基因。生物信息學分析顯示, ScPetC為堿性蛋白, 不同于基因所編碼蛋白質pI值小于7的結果[34], 其主要原因是N端轉移多肽區(qū)內存在多個堿性氨基酸引起ScPetC整體平均pI值大于7。使用SWISSMODEL對ScPetC進行三級結構預測, 其結果表明其與擬南芥PetC成熟蛋白在三維結構上極為相似[44], 說明植物PetC蛋白在結構上極為保守, 極可能行使高度保守的生物學功能。經過仔細比對觀察, 發(fā)現(xiàn)ScPetC三級結構組成是從第55個纈氨酸V開始, N端轉移多肽不在ScPetC成熟蛋白的三維構象中。另外, 在甘蔗與其他植物PetC蛋白三級結構的對比結果中, 我們發(fā)現(xiàn)ScPetC多出一段α螺旋結構(圖3-A), 這或許是ScPetC和SrMV-P1蛋白之間不存在互作的原因, 這與半夏PetC蛋白和SMV-P1蛋白互作的結果有所不同[16]。從所構建的系統(tǒng)進化樹中, 我們發(fā)現(xiàn)甘蔗和高粱的PetC蛋白被聚為一簇, 表明其親緣關系最近, 這和前人研究結果一致[34]。有研究表明, 植物PetC一共有5個外顯子保守區(qū)域[25], 本研究結果顯示, ScPetC有6個motif, 包含了上述的5個保守區(qū)域。因此, 可以推測ScPetC與其他植物PetC具有相似的功能。

蛋白質的生物學功能與其在細胞中的定位密切相關。本研究對ScPetC亞細胞定位進行預測, 結果顯示, 此蛋白定位在葉綠體類囊體的概率最大為65.70%, 細胞質的概率為13.29%, 葉綠體基質的概率為8.95%。在本氏煙葉片中的亞細胞定位分析表明, ScPetC定位在細胞質、細胞膜和葉綠體, 這與擬南芥PetC融合GFP熒光標簽在本氏煙葉片細胞內的亞細胞定位結果相似[44]。課題組前期在SrMV侵染甘蔗的轉錄組研究中, 發(fā)現(xiàn)基因發(fā)生了差異表達, 且在抗感品種中表現(xiàn)出不同的表達模式[37]。前人研究表明半夏PetC和馬鈴薯Y病毒屬SMV-P1蛋白存在互作[16]。但酵母雙雜交實驗結果顯示, SrMV-P1蛋白和ScPetC不存在互作, 因此, 我們比對了SrMV和SMV的P1蛋白氨基酸序列, 發(fā)現(xiàn)相似性只有9.25%; 半夏和甘蔗的PetC蛋白之間相似率為70.74% (圖1-B), 我們推測是序列上的差異導致馬鈴薯Y病毒屬病毒的P1蛋白不能與其寄主PetC蛋白互作, 這種互作可能只存在某些物種之中, 因而基因在宿主受到SrMV侵染時所發(fā)生的差異表達可能是其他未知機制引起的。與此同時, 酵母雙雜交和BiFC實驗結果顯示, ScPetC與SCYLV-P0蛋白互作發(fā)生在細胞膜周和細胞質內, 這和擬南芥PetC蛋白與TuMV-HC-Pro蛋白存在互作的結果相一致[44]。PetC蛋白是由核基因編碼的, 在細胞質中形成蛋白前體, 然后被引導到葉綠體內, 經過加工后的成熟蛋白鉚在類囊體膜上, 參與Cyt bf的形成。因此, 推測SCYLV-P0與ScPetC在細胞質中發(fā)生互作, 可能阻斷了ScPetC由細胞質向葉綠體運輸的過程, 影響了Cyt bf正常組裝, 破壞光合電子傳遞過程, 從而引起了甘蔗葉片變黃等癥狀。另外, SCYLV-P0蛋白和馬鈴薯Y病毒屬病毒HC-Pro蛋白都具有沉默抑制的功能[10, 44], 但ScPetC是否參與P0蛋白沉默抑制作用仍需進一步驗證。

在轉基因融合GUS標簽的擬南芥中,基因在葉片、莖、花、莢均有表達, 在根中卻沒有表達[25]。甘蔗組織表達定量結果顯示,在根中的表達量相對于蔗芽、蔗髓、蔗皮、葉片表現(xiàn)很低; 相反地, 其在葉中表達量最高。該基因之所以會在蔗芽、蔗髓、蔗皮等組織中有少量表達, 可能因為是細胞核基因, 普遍存在于植物不同組織細胞中。課題組前期對感染SrMV的甘蔗易感和抗性品種進行了RNA-seq和qRT-PCR定量相關實驗, 結果表明基因在SrMV易感品種ROC22和FN40中上調表達, 在抗性品種YZ01-1413中下調表達[37]。由于沒有找到SCYLV侵染甘蔗的中間載體, 也無法通過人工對甘蔗實現(xiàn)該病毒的接種, 因此并沒有相關材料。但相關研究表明, SA或MeJa信號通路與病毒侵染相關[13], 因此我們用SA或MeJa模擬病毒等生物脅迫侵染。截至目前, 植物中的基因在ABA、MeJA、SA等激素處理條件的定量表達分析尚無人報道。ABA是響應干旱、鹽脅迫等非生物的關鍵調控因子[45]。在本研究中, 發(fā)現(xiàn)短時間的ABA處理可以引起基因上調表達。推測其原因是: 在施加ABA后, 甘蔗葉片缺水、細胞滲透壓變化, 引起光合效率降低, 植物為了補償光合作用而上調表達光合組分基因, 但長時間的高表達對植物造成負擔, 于是降低基因表達量以適應低光合作用。SA、JA作為植物系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)和誘導系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance, ISP)的重要信號分子[46]。SA、MeJA處理甘蔗后,基因下調表達, 說明在植物受生物脅迫過程中, 植物可能通過抑制的表達, 降低光合作用。用CuCl2、CdCl2溶液處理后, 甘蔗因受到重金屬離子的毒害作用,下調表達。NaCl處理條件下,基因的表達量下降, 這與黃瓜幼苗在NaCl脅迫下, 葉片中的基因的下調表達結果相似, 這同樣可能是由于高鹽環(huán)境的刺激引起了甘蔗葉片氣孔閉合, CO2吸收量下降, 光合電子傳遞速率降低[47]。

4 結論

從甘蔗主栽品種新臺糖22號葉片中成功分離到基因, 該基因長824 bp, 包含一個678 bp的ORF, 編碼226個氨基酸, 含有半胱氨酸和組氨酸[2Fe-2S]結合域, 屬于PRK13474超家族。ScPetC為堿性穩(wěn)定親水非分泌蛋白, 其二級結構只有α螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲; 從ScPetC的序列、三維結構推測, PetC蛋白在植物中高度保守, 具有相似的生物學功能。ScPetC定位于細胞質、葉綠體和細胞膜, 與SrMV-P1蛋白不存在互作, 但與SCYLV-P0蛋白存在互作。基因在甘蔗葉片中的表達量最高, 在蔗肉、蔗芽、蔗皮表達量較低, 在根中幾乎不表達。在外源激素SA和MeJA、重金屬 (CuCl2、CdCl2)和高鹽(NaCl)溶液處理下, 均呈現(xiàn)下調表達; 但短時間ABA處理, 可以引起基因的上調表達。

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Cloning and expression analysis of sugarcane Fe/S precursor protein gene

ZHENG Qing-Lei1, YU Chen-Jing1, YAO Kun-Cun1, HUANG Ning1, QUE You-Xiong1,4, LING Hui2,3,*, and XU Li-Ping1,4,*

1Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture and Rural Area / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;2College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;3College of Crop Science, Yulin Normal University, Yulin 537000, Guangxi, China;4Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding and Comprehensive Utilization, Ministry of Education / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

Cytochrome bf complex Rieske Fe/S precursor protein (PetC) is encoded by the nucleargene, and its mature protein involved in the formation of the cytochromebfcomplex, which is important for electron transfer. Based on our previous transcriptome data of sugarcane (spp. hybrids) infectedby(SrMV), a cytochrome bf complex reduced iron-sulfur precursor protein gene was cloned from leaves of sugarcane superior elite cultivar ‘ROC22’, and named as(GenBank accession number: MH333037.1). Bioinformatics analysis showed that thegene was 824 bp in length, containing a 678 bp open reading frame (ORF), and encoding a peptide of 226 amino acids. ScPetC belongs to the PRK13473 superfamily and has a typical Rieske domain at its C-terminus of the amino acid chain. ScPetC is a stable and hydrophilic protein with pI 8.19. Most of the secondary structural elements in ScPetC were random coil. Compared to the PetC from the other plants, ScPetC contained one more fragment of helix in its third dimensional structure. The transient expression of YFP-fused protein inleaves showed that ScPetC was located in the chloroplast, cytoplasm and cell membrane. Although the previous study indicated that the expression ofwas affected by SrMVinfection in sugarcane, different to the interaction betweenPetC and SMV-P1, without interaction between ScPetC and the SrMV-P1, it did interact with SCYLV-P0, i.e. the P0 protein of(SCYLV). Real-time quantitative PCR analysis showed thatgene was expressed constitutively in different tissues of sugarcane, and the highest level of its expression was found in leaves. When sugarcane plant was exposed to abscisic acid stress for 3 h, the expression ofwas significantly up-regulated, but the expression level was then inhibited with longer treatment time. Under the stress of methyl jasmine, salicylic acid, copper chloride, cadmium chloride and sodium chloride, the expression ofwas significantly down-regulated. The study on biological function, expression pattern and interaction of ScPetC with the proteins of sugarcane pathogenic virus will improve the understanding of the happening of yellow leaf symptom, which caused by SCYLV.

sugarcane; cytochrome bf complex Rieske Fe/S precursor protein; bioinformatics; subcellular location; protein interaction; real-time flourescent quantitative PCR

10.3724/SP.J.1006.2020.94171

本研究由國家自然科學基金項目(31801424)和國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-17)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31801424) and the China Agriculture Research System (CARS-17).

許莉萍, E-mail:xlpmail@126.com; 凌輝, E-mail: linghuich@163.com

E-mail: zhengqinglei1666@163.com.

2019-11-10;

2020-01-15;

(網絡出版日期): 2020-02-17.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200215.1522.002.html