柯紅利，阿周存

（1.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

精子發(fā)生是一個十分復雜的過程，涉及眾多相關基因的時空表達調控。相關基因的表達調控異常會引起生精異常，導致生精障礙，如無精癥、少精癥等〔1〕。微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）通過與靶基因的mRNA結合并沉默靶基因，參與基因的轉錄后調控〔2〕，而轉錄后調控是精子發(fā)生過程基因表達調控的重要方式，是正常生精不可或缺的〔3〕。有研究顯示，miRNA在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，其異?？赡軐е律系K〔4〕。然而，具體哪些miRNA與生精障礙有關還不完全清楚。

近年來，在小鼠模型中的研究顯示，miR-34b/c是小鼠正常生精所必需的miRNA，其異常與小鼠的生精障礙相關〔5〕。這提示miR-34b/c基因也可能與人類生精障礙相關，但目前缺乏相應研究資料。鑒于此，本研究在漢族人群中，對miR-34b/c基因的常見單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點rs4938723的多態(tài)性與少精癥的相關性進行研究，初步探索miR-34b/c基因與少精癥的關系。

1 材料與方法

1.1研究對象病例組由273個少精癥患者組成，來自于四川大學華西醫(yī)院和大理大學第一附屬醫(yī)院，根據(jù)WHO（世界衛(wèi)生組織）指南診斷為少精癥的男性（精子密度小于15×106個/mL）。對照組包括234個精子密度正常的男性。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 PCR擴增 用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，從研究對象的外周血中提取基因組DNA。SNPrs4938723的PCR擴增引物序列為：5'-CTCTGGGAACCTTCTTTGACCCAT-3'和 5'-TGAGATCAAGGCCATACCATTCAAGA-3'，擴增片段的長度為147 bp。PCR擴增反應的體積為25μL，反應的條件為：94℃預變性5 min，隨后進行35個循環(huán)（94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s），最后72℃延伸5 min。

1.2.2 基因分型 利用限制性片段長度多態(tài)性分析對SNP rs4938723進行基因分型。取PCR產(chǎn)物10μL，用10個單位的限制性內切酶BclⅠ消化過夜，然后在3%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。基因型TT為1條帶（147 bp），TC為3條帶（147 bp，118 bp和29 bp），CC為2條帶（118 bp和29 bp）。通過對不同基因型的部分標本進行PCR產(chǎn)物直接測序，對電泳分型結果進行驗證。

1.2.3 統(tǒng)計學分析 通過計數(shù)計算基因頻率和基因型頻率。用HWE計算器進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。用χ2檢驗比較患者組和正常對照組之間等位基因和基因型頻率之間的差異，檢驗水準設為P＜0.05。

2 結果

檢測到miR-34b/c基因SNP rs4938723位點所具有的TT、TC、CC全部3種基因型。測序結果與電泳分型結果一致，表明所采用的基因分型方法可靠。見圖1。

圖1 SNPrs4938723的電泳分型結果

SNPrs4938723的等位基因頻率和基因頻率分布在少精癥患者和正常男性間的差異具有統(tǒng)計學意義；少精癥患者的等位基因C的頻率（35.0%vs.28.2%，P=0.021，OR=1.378，95%CI為1.048～1.789）和基因型CC的頻率（13.9%vs.7.3%，P=0.016，OR=2.064，95%CI為1.132～3.764）顯著高于正常男性。見表1。經(jīng)HWE計算器分析檢驗，SNP rs4938723的基因型分布在少精癥患者和正常男性中符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

3 討論

近年來，一系列研究結果顯示，miR-34b/c基因的SNP位點rs4938723的多態(tài)性影響多種疾病的發(fā)病風險，如冠心病、缺血性中風、類風濕性關節(jié)炎和癌癥等〔6-10〕，提示miR-34b/c基因可與不同的疾病的發(fā)生有關。然而，miR-34b/c基因與生精障礙的關系尚未明確。鑒于miR-34b/c基因在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，推測miR-34b/c基因也可能與人類的生精障礙相關。為了驗證上述推測，本研究在273個少精癥患者和234個正常男性中，對miR-34b/c基因SNP位點rs4938723的多態(tài)性分布進行調查。研究結果顯示，SNPrs4938723的基因型分布在少精癥患者和正常人群中符合Hardy-Weinberg平衡，表明本研究的對象具有群體代表性；在少精癥中SNP rs4938723的等位基因C的頻率和基因型CC的頻率顯著高于正常人群，提示SNP位點rs4938723的多態(tài)性與少精癥相關，基因型CC可能增加少精癥的發(fā)病風險（OR=2.064）。

表1 兩組患者rs4938723的等位基因頻率和基因型頻率分布［n（%）］

雖然本研究的結果表明SNP rs4938723的CC基因型可能增加無精癥的發(fā)病風險，但具體機制還不清楚。SNP rs4938723是一個位于miR-34b/c基因啟動子區(qū)的C/T變異，其影響相關轉錄因子與啟動子的結合進而影響啟動子的活性；與等位基因T相比，等位基因C會降低啟動子的活性，使miR-34b/c表達水平下調，導致CC基因型個體的miR-34b/c表達水平顯著低于TT和TC基因型個體〔11〕。有研究顯示，在無精癥和少弱精癥患者的睪丸組織或精子中，miR-34b/c的表達水平顯著降低，而在正常生精個體中則高表達，提示miR-34b/c的表達水平降低可能影響精子的數(shù)量〔12-13〕。此外，在小鼠中的研究表明，高miR-34b/c表達水平是有效調控生精過程中一些關鍵基因（如Nanos 2基因等）的表達，從而確保生精過程正常進行所必需的〔14-15〕。因此，CC基因型個體的miR-34b/c表達水平降低，可能影響正常的生精過程，進而引起精子數(shù)量的減少。這可能是本研究所發(fā)現(xiàn)的CC基因型增加少精癥發(fā)病風險的一個原因。

目前，尚未見有關miR-34b/c基因的多態(tài)性與生精障礙相關性的研究報道。本研究首次對miR-34b/c基因SNP位點rs4938723的多態(tài)性與少精癥的關系進行調查，發(fā)現(xiàn)SNPrs4938723的多態(tài)性與少精癥相關，SNPrs4938723的CC基因型可能增加少精癥的發(fā)病風險，提示miR-34b/c基因可能參與了少精癥的發(fā)病。研究結果為進一步闡明miR-34b/c基因在人類生精障礙中的作用提供一些有價值的參考。