黃 銳，袁 淵，任桂林，趙 劍，楊思進，李 志，蒲清榮

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646000）

痛風（gout）是由單鈉尿酸鹽（MSU）沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)，特指急性特征性關(guān)節(jié)炎和慢性痛風石疾病〔1〕。中醫(yī)藥學在痛風的防治方面以清熱利濕、活血止痛為原則，顯示出縮短病程、降低費用、減少并發(fā)癥等獨特優(yōu)勢，已得到國內(nèi)外醫(yī)學界的認同〔2〕。隨著國內(nèi)外對痛風研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)痛風的發(fā)病機制與炎癥反應和免疫機制密切相關(guān)〔3〕。茜花制劑原方是治療痛風的經(jīng)驗方，由茜草、花椒、通草組成，日服量不超過20 g原生藥材，具有涼血散瘀、通絡止痛、清熱利尿的功效，主要用于治療痛風引起的關(guān)節(jié)或肌肉的紅、腫、熱、痛、麻等癥。

由于原方是用60度以上的高粱酒浸泡而成的酒劑，味苦，課題組在不降低臨床療效的基礎(chǔ)上，從口感、制劑成本、生產(chǎn)時間等多個方面考慮，擬將酒劑改為膠囊劑，本試驗結(jié)合藥效學試驗優(yōu)選茜花制劑的初步工藝，并利用正交試驗以有效成分的相對含量為評價指標，確定最佳提取工藝，為茜花制劑的實際生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT泵、SPD20A檢測器、CTO-10AS進樣器、LcSolution色譜工作站）；AUW120D電子天平（日本島津）；JP全數(shù)字超聲波發(fā)生器（武漢嘉鵬電子有限公司）；AU680全自動生化分析系統(tǒng)（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2試劑對照品大葉茜草素（中國食品藥品檢定研究院，批號：111898-201102）；茜草、花椒、通草均購自瀘州天植中藥飲片有限公司，批號分別為160201、160101、160101，經(jīng)西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室趙劍主任中藥師鑒定，符合《中華人民共和國藥典》（2015年版）一部該藥材項下規(guī)定；酵母膏（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司，批號：20160518）；腺嘌呤（武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司，批號：03-004-1603009）；甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑為分析純。

1.3材料雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（川）2013-2017。

2 方法

2.1提取工藝

2.1.1 水提 按處方比例花椒除外稱取3倍全方藥材，加12倍水煎煮3次，每次1 h，過濾，濾液合并，濃縮成1 g/mL，加入花椒粉即為樣品溶液，備用。

2.1.2 不同濃度的醇加水提 按處方比例花椒除外稱取全方藥材，加入6倍量不同濃度的乙醇浸泡48 h，滲漉速度為1 mL/min，收集滲漉液，備用。藥渣加處方量12倍水煎煮3次，每次1 h，過濾，濾液與上述滲漉液合并，濃縮成1 g/mL，加花椒粉即為樣品溶液，備用。

2.2大葉茜草素的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取大葉茜草素的對照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.153 g/L的對照品溶液。

2.2.2大葉茜草素的相對含量測定 取“2.1”項的各樣品溶液，用65%乙醇定容至600 mL，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 除茜草外按處方比例取藥材，按“2.1.2”項提取，按“2.2.2”項制備，即得。

2.3藥效學實驗

2.3.1 給藥劑量 茜花制劑臨床經(jīng)驗用量為16 g原生藥，成人每日用量為0.266 7 g/kg（成人體質(zhì)量按60 kg計），按成人給藥劑量乘6.25計算大鼠給藥劑量。

2.3.2 高尿酸血癥大鼠模型制備和給藥 取SD雄性大鼠96只，隨機分為8個組，每組12只，分別為正常組、模型組、別嘌醇組（3.5 mg/kg）、5個實驗組。除正常組外，其余各組大鼠灌胃給予酵母膏15 g/kg和腺嘌呤200 mg/kg，每日1次，于第7天灌胃給予各實驗組大鼠對應劑量的藥物，正常組、模型組給予等量蒸餾水，每日1次，持續(xù)7 d，第7天給藥1 h后斷尾取血檢測尿酸水平〔4-6〕。

2.4正交試驗選“2.2”與“2.3”項大葉茜草素含量較高，且藥效較好的實驗組，采用正交實驗對粉碎粒度、乙醇用量、浸泡時間、滲漉速度4個因素進行考察。

2.5數(shù)據(jù)處理與分析所有數(shù)據(jù)使用Excel建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果以（±s）表示，統(tǒng)計方法采用方差分析，組間數(shù)據(jù)比較采用雙側(cè)t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1大葉茜草素含量測定結(jié)果

3.1.1 色譜條件 色譜柱Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液（25：50：25），流速1.0 mL/min，柱溫40℃，檢測波長250 nm，進樣量10μL〔7-9〕。見圖1。

圖1 茜花制劑高效液相色譜圖

3.1.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項下對照品溶液0.4、0.8、1.0、2.0、4.0 mL分別于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，按“3.1.1”項下色譜條件，取10μL進樣檢測。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=4.056×107x+16 607.83，r=0.999 6，線性范圍為0.006 12～0.061 20 g/L。

3.1.3 精密度試驗 取“2.2.1”項對照品溶液10μL，按“3.1.1”項色譜條件，連續(xù)進樣6次，測得大葉茜草素峰面積RSD為0.93%，表明儀器精密度良好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“3.1.1”項色譜條件測定，大葉茜草素峰面積的RSD為1.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.5 重復性試驗 取正交試驗1號樣品，按“3.1.1”項進行測定，進樣6次，計算得大葉茜草素平均含量為34.82μg/mL，RSD為1.82%。

3.1.6 回收率試驗 精密量取正交試驗1號樣品6份，每份1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加入“2.2.1”項對照品溶液0.2 mL，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“3.1.1”項色譜條件測定，計算回收率。加樣回收率平均值為98.18%，RSD為1.4%，表明該方法切實可行。

3.1.7 大葉茜草素含量測定 取“2.2.2”項制備的供試溶液，按“3.1.1”項色譜條件進樣測定。

3.2藥效學實驗結(jié)果模型組大鼠尿酸水平比正常組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示造模成功；別嘌醇組、65%工藝組大鼠尿酸水平與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而與模型組比較，兩組大鼠尿酸水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果表明持續(xù)給藥第7天，僅別嘌醇組與65%工藝組能顯著降低高尿酸血癥大鼠尿酸水平。見表1。

表1 不同提取工藝對大葉茜草素含量和高尿酸血癥大鼠尿酸水平的影響

3.3正交試驗由表1可知，65%工藝組大葉茜草素含量為174.04μg/mL，較其他工藝組高，藥效學試驗也表明該組能顯著降低高尿酸血癥大鼠的尿酸水平。因此，選用65%乙醇作為滲漉濃度，選擇粉碎粒度、乙醇用量、浸泡時間、滲漉速度為考察因素，收集滲漉液，測定大葉茜草素的含量，正交試驗因素水平見表2。

正交試驗設計方案及結(jié)果見表3，方差分析見表4。由試驗結(jié)果可知，各因素對提取效果影響主次為A＞B＞D＞C。方差分析結(jié)果顯示因素A即粉碎粒度和因素B即乙醇用量對滲漉工藝有顯著影響，因素C、D無顯著性影響，選擇最佳提取工藝為

表2 正交試驗因素水平

表3 L9（34）正交試驗設計方案及結(jié)果

表4 正交試驗方差分析

3.4復核試驗按處方比例稱取藥材3份，按優(yōu)選的提取工藝A3B3C1D2即將藥材粉碎過五號篩，加8倍量65%乙醇浸泡24 h，滲漉速度為2 mL/min進行提取，按“3.1.1”項下方法測定大葉茜草素含量為216.27、216.71、213.03μg/mL，RSD為0.93%，提取率為60.45%、60.58%、59.55%，RSD為0.93%。說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，提取率較高。

4 討論

君藥茜草具有涼血、止血、祛瘀、通經(jīng)功效，用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、經(jīng)閉瘀阻、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛〔4〕，是茜花制劑中涼血散瘀、止痛作用的主要藥物，其主要成分大葉茜草素是從茜草中分離出的萘醌類化合物，具有明顯的生物活性〔10-11〕。課題組通過藥效學及正交試驗考察粉碎粒度、乙醇用量、浸泡時間、滲漉速度對茜花制劑提取工藝的影響，確定最佳工藝為：藥材粉碎過五號篩，加8倍量65%乙醇浸泡24 h，滲漉速度為2 mL/min。該方作為治療痛風的經(jīng)驗方，用60度以上的高粱酒浸泡而成，療效佳，因此，用65%乙醇提取也與原工藝相符。

建立高尿酸血癥模型是本試驗進行藥效學篩選的關(guān)鍵，酵母膏加腺嘌呤致大鼠高尿酸血癥試驗需注意大鼠對酵母膏和腺嘌呤的耐受性，熟練灌胃，避免對大鼠造成不必要的傷害而導致死亡；靜脈取血避免溶血現(xiàn)象發(fā)生，離心時應盡量取澄清的血清進行尿酸檢測，避免出現(xiàn)個別尿酸值異常偏高。選擇酵母膏加腺嘌呤致大鼠高尿酸血癥模型對工藝進行初步篩選，對優(yōu)選出的滲漉條件更具科學意義。