王延震，李 炯，甘義榮，寇宗科，張云龍，梁天香，冒 銳，謝定雄△

1甘肅省心血管病研究所，蘭州 7300502蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)又稱為缺血性心臟病、冠心病，是嚴(yán)重的心血管疾病之一，亦為人類重要死亡原因之一[1-2]。僅2015年世界范圍內(nèi)有1.1億的新發(fā)冠心病患者，死亡高達(dá)890萬人。目前我國冠心病患者約有1100萬人，其病死率呈上升趨勢[3]。動脈粥樣硬化為多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ)，受遺傳、免疫紊亂、慢性炎癥及脂質(zhì)代謝異常等因素影響，其病程涉及脂質(zhì)在血管內(nèi)膜沉積、內(nèi)皮細(xì)胞受損、血小板和白細(xì)胞(單核細(xì)胞)粘附、侵襲伴平滑肌細(xì)胞和膠原纖維增生、泡沫細(xì)胞形成等。CAD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其危險因素包括高血壓、冠心病家族史、高脂血癥、吸煙、肥胖等[4]。相關(guān)研究表明，胰島素樣生長因子2B mRNA(IGF2B mRNA)通過結(jié)合蛋白參與動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)，而長鏈非編碼RNA(lncRNA)已被證實可能具有調(diào)控IGF2B mRNA蛋白表達(dá)的作用，本研究旨在探討lncRNA AB07361在CAD患者血清中的表達(dá)及其臨床意義。以期為明確影響CAD病理生理進(jìn)程的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，對CAD患者實行早診斷，有效降低其病死率而提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年3月～2019年6月于甘肅省心血管病研究所行冠狀動脈CT或冠脈造影符合納入條件的CAD患者96例為CAD組，其中男性41例、女性55例，平均年齡(62.73±10.41)歲；同時選取同期住院的非CAD患者96例為對照組，其中58例女性、38例男性，平均年齡(63.12±10.64)歲。患者均行造影或冠脈CT檢查，對右冠狀動脈、左前降支、左回旋支、左主干等主要血管至少予以3處多體位測定，若結(jié)果顯示狹窄超過直徑50%的血管>1支，即可確診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CAD)。排除腫瘤患者、急慢性感染性疾病者、嚴(yán)重肝腎功能損壞者、周圍血管性疾病及血液系統(tǒng)疾病患者、瓣膜性心臟病患者、心律失常者。此研究經(jīng)我所倫理委員會批準(zhǔn)通過，受試者均知情并簽署同意書。兩組患者血糖、血脂、血壓水平、體重、身高、年齡、性別等一般臨床資料具有可比性(表1)。

1.2 血液樣品采集

受試者清晨7：00空腹抽肘靜脈血7 mL，并將血液樣本置于EDTA抗凝管中，4℃下3000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.3 應(yīng)用測序方法對9p21基因區(qū)域3種單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分型

提取受試血液樣本基因組DNA，PCR擴(kuò)增9p21含3種單核苷酸(rs1333049、rs564398、rs2811712)多態(tài)性位點的區(qū)域，應(yīng)用測序方法分型。在20 μL的PCR擴(kuò)增體系中，加入1 μL基因組DNA后在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上設(shè)置程序：95℃變性15 min；95℃30 s、56℃1 min、72℃1 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積ddH2O稀釋，作為連接反應(yīng)的模板，在1.5 mL Eppendorf離心管中分別加入100 μL buffer(×10)，100 μL Probe Mix，5 μL連接酶，695 μL去離子水?；靹蚝笕? μL分裝在200 μL的PCR反應(yīng)管中，最后再加入1 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上設(shè)置程序：95℃變性2 min；94℃30 s、56℃1 min，35個循環(huán)；50℃2 min。將PCR反應(yīng)管放入PCR儀中進(jìn)行連接反應(yīng)，各取1 μL LDR連接產(chǎn)物與1 μL ABI GS-500ROX熒光標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)和1 μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2 min，冰中驟冷，在5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中3000 V電泳2.5 h，應(yīng)用GENESCAN672軟件對數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、遷移片段大小測量和矯正內(nèi)在分子量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和基因分型。

1.4 qRT-PCR法測定外周血中l(wèi)ncRNA AB07361等的表達(dá)

在人類基因組上，AB07361、CDKN2A、CDKN2B基因在9p21染色體上連鎖排列，是細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子的調(diào)控區(qū)域，因此本次研究從GenBank獲得AB07361、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH序列，采用Primer 6.0軟件設(shè)計引物(表2)。建立10 μL反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，ddH2O 1 μL，上下游引物(由武漢金凱瑞公司合成)各1 μL，2×SYBR GREEN Master Mix 5 μL。設(shè)置RT-PCR反應(yīng)條件為：95℃反應(yīng)30 s；95℃反應(yīng)10 s、60℃反應(yīng)30 s，35個循環(huán)。目的基因表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計算。

表2 lncRNA各引物序列Table 2 Primer sequences of lncRNA

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 23.0軟件和GraphPad Prism系統(tǒng)，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者外周血中l(wèi)ncRNA AB07361表達(dá)水平比較

qRT-PCR結(jié)果表明，在CAD患者外周血中l(wèi)ncRNA AB07361的相對表達(dá)量顯著高于非CAD患者，(4.352±0.223)vs.(1.623±0.145)，P<0.05。

2.2 lncRNA AB07361表達(dá)水平對CAD診斷的效能

ROC分析lncRNA AB07361的表達(dá)見圖1，當(dāng)Cut-off值為3.026，曲線下面積(AUC)值為0.883時，診斷CAD的特異度為85%，靈敏度為75%。

2.3 比較CAD與9p21區(qū)域多態(tài)性單核苷酸的相關(guān)性

分析測定了對照組及CAD組9p21基因區(qū)域3種單核苷酸rs1333049、rs564398、rs2811712的等位基因分布情況。結(jié)果表明：在兩組受試者中rs1333049、rs564398、rs2811712的等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4 lncRNA AB07361表達(dá)與rs1333049等位基因G頻率的關(guān)聯(lián)性

對CAD組lncRNA AB07361(外顯子17-18)、lncRNA AB07361(外顯子1-2)與rs1333049等位基因G頻率的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者均呈正相關(guān)(r=0.341，0.313，均P<0.05)，見圖2。

2.5 lncRNA AB07361表達(dá)與CDKN2A、CDKN2B表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

分別對冠心病組lncRNA AB07361表達(dá)與CDKN2B、CDKN2A表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：lncRNA AB07361(外顯子17-18)表達(dá)與CDKN2A的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.548，P<0.01)，而與CDKN2B的表達(dá)無相關(guān)性；lncRNA AB07361(外顯子1-2)與CDKN2A、CDKN2B表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.652，0.518，均P<0.05)，見圖3。

圖1 ROC分析lncRNA AB07361的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA AB07361 by ROC analysis

表3 兩組患者單核苷酸等位基因頻率比較[例(%)]Table 3 Comparison of single nucleotide allele frequencies between the two groups[n(%)]

圖2 rs1333049等位基因G頻率與lncRNA AB07361表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of rs1333049 allele frequency G and lncRNA AB07361 expression

圖3 lncRNA AB07361與CDKN2A、CDKN2B相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between lncRNA AB07361 and CDKN2A，CDKN2B

3 討論

為提高冠心病患者早期診斷率，實現(xiàn)早期治療，改善患者臨床癥狀，尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點成為最新研究方向[5]。lncRNA是擁有200個以上核苷酸的RNA分子，其可從轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后多層面地對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，同時影響信號分子通路，因而在分子生物學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注[6]。lncRNA較mRNA表達(dá)水平低，但諸多證據(jù)表明，lncRNA在胚胎干細(xì)胞發(fā)育和分化過程中起關(guān)鍵作用。全基因組研究顯示，lncRNA為細(xì)胞特異性，可反映表觀遺傳學(xué)的作用[7]。lncRNA參與了血管生成與功能、炎癥反應(yīng)、斑塊的形成、脂質(zhì)沉積、血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖等調(diào)節(jié)過程，而冠心病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后則與其異常表達(dá)相關(guān)。

單核苷酸在染色體9p21區(qū)域中表達(dá)極為豐富，其通常與疾病密切相關(guān)，臨床中包括動脈粥樣硬化性疾病、心肌梗死、顱內(nèi)動脈瘤等在內(nèi)的心血管疾病，以及內(nèi)分泌代謝疾病如2型糖尿病等均與該區(qū)域有關(guān)[8-9]。同時它還與皮膚痣、黑色素瘤、牙周炎和阿爾茨海默病、白血病和青光眼等遠(yuǎn)緣病因的疾病亦存在關(guān)聯(lián)[10-11]。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)目前也已確定染色體9p21區(qū)域遺傳變異的基因與心血管疾病的發(fā)生具有密切關(guān)聯(lián)[12]。鑒于此，本研究對CAD組及對照組患者9p21區(qū)域的rs1333049、rs564398和rs2811712等3種單核苷酸表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析了其不同基因型在CAD患者中的差異性表達(dá)。結(jié)果表明：在兩組受試者中rs1333049、rs2811712與rs564398等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

近期研究表明，lncRNA可通過調(diào)節(jié)基因的增強(qiáng)子和啟動子對周圍基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以從轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳學(xué)等多個方面調(diào)控基因表達(dá)，從而對細(xì)胞的增殖、凋亡和損傷、自噬予以調(diào)節(jié)，以此參與疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[13-14]。

本研究結(jié)果顯示：① lncRNA AB07361在CAD患者外周血中的相對表達(dá)量顯著高于非CAD患者。采用ROC分析，AUC為0.883，以此判斷l(xiāng)ncRNA AB07361可作為輔助診斷CAD的分子標(biāo)志物，其診斷CAD的特異度為85%，靈敏度為75%時，Cut-off值為3.026。但本研究對象局限于單一地區(qū)的漢族人群，且所納入樣本量偏少，我們將在后續(xù)的研究中擴(kuò)大研究樣本量，進(jìn)而明確是否可以將lncRNA AB07361作為診斷CAD的分子標(biāo)志物。②冠心病患者lncRNA AB07361(外顯子17-18)、AB07361(外顯子1-2)與rs1333049等位基因G頻率均呈正相關(guān)。③lncRNA AB07361(外顯子17-18)與CDKN2A的表達(dá)呈正相關(guān)，lncRNA AB07361(外顯子1-2)與CDKN2A、CDKN2B表達(dá)呈正相關(guān)。

總之，lncRNA AB07361或通過調(diào)控CDKN2A、CDKN2B的表達(dá)而影響CAD的發(fā)生發(fā)展，而lncRNA AB07361的表達(dá)可能受染色體9p21區(qū)域單核苷酸rs1333049表達(dá)的影響。lncRNA AB07361或可成為早期鑒別和診斷CAD的分子標(biāo)志物，在臨床上具有良好應(yīng)用前景，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。