王俊力，邵 衛(wèi)，楊 運，羅衛(wèi)東，張忠文，梅俊華，陳國華

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，它在防御感染和損傷大腦的神經(jīng)炎癥免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[1]，然而異常激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致多種促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子的過度表達，從而引起神經(jīng)變性相關(guān)疾病(包括帕金森病、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化、亨廷頓病和缺血性腦卒中)[2-4]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活可能對多種神經(jīng)炎癥相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)后具有重要意義。本研究通過觀察脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子及相關(guān)信號通路分子表達的影響，探討不同活化程度的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞與炎性介質(zhì)之間的關(guān)系及其可能的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以期建立高效穩(wěn)定的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞和主要試劑

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；高糖DMEM培養(yǎng)液、青霉素和鏈霉素、0.25%胰酶(含EDTA)購于Hyclcone公司；胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；脂多糖(LPS)購于Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)購于DOJINDO公司；NO檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒購于深圳欣博盛生物科技有限公司；Prime ScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRTMPremix Ex Taq TMⅡ(Perfect Real Time)購于TaKaRa公司；兔來源髓樣分化因子88(MyD88)多克隆抗體購于Affinity公司；兔來源Toll樣受體4(TLR4)單克隆抗體購于Abcam公司；小鼠來源β-actin單克隆抗體購于Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗購于EARTH公司。

1.2 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天傳代。

1.3 CCK-8法繪制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞生長曲線

將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞消化，細(xì)胞計數(shù)后以每孔5×107/L接種到96孔板中，每孔100 μL，每板4孔，共計7板；細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)6 d，第2、4、6天按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)換液，每次換液后培養(yǎng)液為100 μL；分別于接種后第0、1、2、3、4、5、6天取1板細(xì)胞進行檢測，向每孔中加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(A)值，最終以測定時間為橫軸，每次吸光度值的平均值為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 CCK-8法檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性

取對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×107/L接種到96孔板中，每孔100 μL。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)，24 h后棄去上清液，PBS清洗3次，向每孔中加入100 μL無血清高糖DMEM和CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的A值；實驗中分別設(shè)立空白組和對照組，每組設(shè)立4個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.5 Griess法測定NO水平

將對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞消化，細(xì)胞計數(shù)后以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種到24孔板中培養(yǎng)。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)，24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，每組各取50 μL加到96孔板中，再分別加入50 μL Griess試劑Ⅰ和Ⅱ，振蕩混勻后避光反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀測定540 nm處的A值。各組中NO含量依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。

1.6 qRT-PCR檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88 mRNA的表達

將對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞消化，細(xì)胞計數(shù)后以每孔2.5×105個細(xì)胞的密度接種到6孔板中培養(yǎng)。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)，24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次。按照RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)分光光度計測定濃度和純度后，進行逆轉(zhuǎn)錄合成(反應(yīng)體積20 μL)cDNA。然后以cDNA為模板進行PCR擴增，其反應(yīng)方案為：95℃，1 min，預(yù)變性；95℃15 s，58℃20 s，72℃20 s，循環(huán)40次；72℃，末段延伸5 min；熔解曲線：72℃～95℃，每20 s升溫1℃，所用引物序列見表1，每組設(shè)3個復(fù)孔，使用GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達量，結(jié)果以TLR4、MyD88與GAPDH mRNA表達量的比值表示。

表1 qRT-PCR檢測所用的引物序列及長度Table 1 Primer sequences of qRT-PCR detection

1.7 Western blot檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88蛋白的表達

將對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞消化，細(xì)胞計數(shù)后以每孔2.5×105個細(xì)胞的密度接種到6孔板中培養(yǎng)。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)，24 h后棄去培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次。加入蛋白酶抑制劑與RIPA裂解緩沖液的混合液提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，計算出含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。以β-actin為內(nèi)參，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃水浴5 min。取各組蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉(0.5%TBST配制)常溫?fù)u床封閉1 h。分別加入小鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗TLR4抗體、兔抗MyD88抗體后4℃過夜。TBST洗膜3次(10 min/次)后分別加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶5000)、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)室溫下孵育30 min，TBST再次洗膜后加入等體積混勻的ECL化學(xué)發(fā)光試劑A和B，均勻滴加到膜的蛋白面，保持1～2 min后放入凝膠成像儀中曝光成像，應(yīng)用Image J軟件進行各組樣本條帶灰度值分析，結(jié)果以TLR4、MyD88蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示。

1.8 ELISA法檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β含量

對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×107/L接種到96孔板中培養(yǎng)，每孔100 μL。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后加入LPS(1 μg/mL)，24 h后收集BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液。用ELISA試劑盒檢測TNF-α和IL-1β水平，具體操作步驟按ELISA試劑盒說明書進行。用酶標(biāo)儀測定450 nm處的A值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α和IL-1β的含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的生長曲線

根據(jù)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞生長曲線可知，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)后第0～2天是生長緩慢的潛伏期，第2～3天是對數(shù)生長期，第3～5天是平頂期，生長曲線呈平臺狀，第5天后細(xì)胞開始衰亡(圖1)。取對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用于后續(xù)實驗研究。

圖1 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞生長曲線Fig.1 Growth curve of BV2 microglia

2.2 LPS對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2為靜息狀態(tài)下的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體小，并具有伸向各個方向的細(xì)長突起；圖3為經(jīng)LPS(1 μg/mL)刺激后的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體增生肥大，突起減少且回縮變短，呈圓形或桿狀，形態(tài)呈現(xiàn)類阿米巴樣。

圖2 靜息狀態(tài)BV2細(xì)胞形態(tài)(×100)Fig.2 Morphology of resting BV2 microglia(×100)

2.3 LPS對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

以對照組A值為標(biāo)準(zhǔn)(100%)，其余各組A值與對照組比值代表各組細(xì)胞存活率，LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后能明顯降低細(xì)胞存活率，且在實驗劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性；不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后細(xì)胞存活率分別為(0.944±0.023)、(0.860±0.023)、(0.761±0.026)、(0.636±0.015)、(0.537±0.017)，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4 LPS對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放的影響

LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后能顯著提高NO的釋放量，且在實驗劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，LPS濃度為0.25、0.5、1、2、4 μg/mL時，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放量分別為(7.947±0.089)、(10.835±0.292)、(13.132±0.590)、(16.790±0.631)、(23.100±0.751)μmoL，與對照組(4.142±0.140)μmoL比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.5 qRT-PCR檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4和MyD88 mRNA的表達

由圖4可知，LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后TLR4和MyD88 mRNA的表達較相應(yīng)對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；且TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表達隨著LPS濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在LPS 1 μg/mL時達到峰值。

與對照組比較，*P<0.05圖4 qRT-PCR檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4和MyD88 mRNA表達Fig.4 Detection of TLR4 and MyD88 mRNA expression in BV2 microglia by qRT-PCR

2.6 Western blot檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4和MyD88蛋白的表達

從圖5可見，LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后TLR4和MyD88蛋白的表達較相應(yīng)對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；且TLR4蛋白和MyD88蛋白的表達隨著LPS濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在LPS 1 μg/mL達到峰值。

2.7 ELISA法檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β濃度的變化

LPS(1 μg/mL)作用后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的濃度明顯增高[(1115.547±42.269)vs.(128.198±11.077)]，IL-1β的濃度也明顯增高[(98.390±8.831)vs.(16.040±0.285)]，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

與對照組比較，*P<0.05圖5 Western blot檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4和MyD88蛋白表達Fig.5 Detection of TLR4 and MyD88 protein expression in BV2 microglia by Western blotting

3 討論

大量研究表明，神經(jīng)炎癥反應(yīng)可引起神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常及氧化損傷，從而在阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化和帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[5-6]。多項前瞻性研究顯示，健康受試者長期服用非甾體類抗炎藥物可降低阿爾茨海默病和帕金森病的患病率，這間接地表明神經(jīng)炎癥反應(yīng)在神經(jīng)變性性疾病發(fā)病過程中起重要作用[7-11]。因此，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)必將為阿爾茨海默病、帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的思路和方案。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫效應(yīng)細(xì)胞，它被激活后主要分化為發(fā)揮促炎作用的M1型和起抗炎作用的M2型[12-14]。在阿爾茨海默病發(fā)病過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞通過清除細(xì)胞外和早期彌漫斑塊內(nèi)的Aβ可以有效促進Aβ的產(chǎn)生與清除之間的平衡，有利于腦內(nèi)損傷的修復(fù)；然而，隨著不溶性Aβ在斑塊內(nèi)聚集的形成，小膠質(zhì)細(xì)胞被異常激活，并通過自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)，如腫瘤壞死因子、白介素-1β、白介素-6、一氧化氮和活性氧(ROS)等，這些介質(zhì)對神經(jīng)元產(chǎn)生強烈的毒性作用，導(dǎo)致腦內(nèi)損傷的進一步惡化[15-17]。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少炎癥介質(zhì)的表達，從而減輕神經(jīng)炎癥損傷是阿爾茨海默病研究的主要靶向之一。

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞是小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染v-raf/v-myc后獲得永生化的細(xì)胞系。該細(xì)胞系高度純化，且保留有小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、表型及各種功能，是研究小膠質(zhì)細(xì)胞理想的體外模型。脂多糖(LPS)為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的特征成分，它與小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的TLR4受體結(jié)合啟動TLR4信號通路的傳導(dǎo)。TLR4通過其銜接蛋白MyD88和TRIF途徑下傳信號，其中MyD88途徑是經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑，其誘導(dǎo)的信號主要產(chǎn)生促炎介質(zhì)[18-20]。因此，建立高效穩(wěn)定的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型和探討B(tài)V2小膠質(zhì)細(xì)胞激活的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)機制對阿爾茨海默病的體外研究尤為重要。

本實驗分別用不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞被LPS激活后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增生肥大，突起減少回縮變短，呈圓形或桿狀，形態(tài)呈現(xiàn)類阿米巴樣；LPS能明顯降低BV2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率及提高NO釋放量，且在實驗劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；TLR4、MyD88 mRNA及蛋白的表達隨著LPS濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且均在LPS 1 μg/mL時達到峰值；LPS(1 μg/mL)誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后顯著提高TNF-α和IL-1β濃度。

綜上所述，LPS可能通過TLR4信號通路誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化，進而上調(diào)其炎性介質(zhì)的水平。同時結(jié)合本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1 μg/mL LPS是建立高效穩(wěn)定BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型的最佳濃度。TLR4信號通路可能是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活、減少炎癥損傷的關(guān)鍵靶點。尋找和開發(fā)靶向調(diào)控TLR4信號通路的藥物可能對阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)炎癥反應(yīng)的控制及預(yù)后改善具有重要意義。當(dāng)然，靶向調(diào)控TLR4信號通路的藥物還需在今后的動物實驗和臨床研究中進一步驗證。