蒲江濤，唐小軍，胡 智，張登國，張 濤，戴天陽

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院胸外科,瀘州 646000

肺癌是較為常見的惡性腫瘤，近年來肺癌發(fā)病率呈上升趨勢，由肺癌所導致的死亡率居各種癌因死亡的首位[1]。肺癌可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)兩大類，NSCLC約占肺癌的80%[2]，盡管針對NSCLC的治療方法已經(jīng)取得了長足的進步，然而隨著腫瘤耐藥的日趨嚴重，NSCLC患者5年生存率仍較差，因此尋找NSCLC有效分子標志物以及潛在治療靶點，對改善NSCLC患者預后具有重要的臨床意義。哺乳動物中的Sirtuin(SIRT)家族在細胞增殖、衰老調(diào)控、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多個方面發(fā)揮著重要的作用[3]。SIRT6是SIRT家族中的一員，目前已被證實在胰腺癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起作用[4-5]。胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)通過抑制腫瘤細胞凋亡調(diào)控腫瘤發(fā)展[6]。在腫瘤細胞進入G1期后，IGF1R可促使細胞進入G2/M期，促進腫瘤細胞增殖，而這一作用是通過調(diào)控其下游的AKT表達完成的[7]。Takasaka等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6可通過減弱IGF1R/AKT信號傳導的自噬誘導參與人支氣管上皮細胞衰老?？紤]到NSCLC中AKT通路的異常激活[9]，我們推測SIRT6具有抑制NSCLC進展的潛能，但SIRT6在NSCLC中的作用及相關(guān)機制卻鮮見報道?；诖?，本研究通過檢測NSCLC癌組織、癌旁組織及NSCLC細胞A549、人支氣管上皮細胞16HBE中SIRT6表達，并在A549細胞中干擾/過表達SIRT6，檢測細胞增殖和凋亡及IGF1R、AKT表達情況，探討SIRT6在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集2018年12月至2019年1月期間，經(jīng)我院手術(shù)治療的12例NSCLC患者癌組織及距腫瘤切緣2 cm以上的癌旁組織(鏡下觀察未見癌細胞)，樣本取出后立即置于液氮中保存。納入標準：①病理學證實為NSCLC；②術(shù)前未接受放療、化療或其他抗癌治療；③患者臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并除NSCLC外的其他慢性消耗性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準；所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。其中，男性7例，女性5例，年齡范圍46～75歲，平均年齡(56.25±11.15)歲。

1.2 細胞來源與培養(yǎng)

NSCLC細胞A549以及人支氣管上皮細胞16-HBE均購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。上述細胞均接種于RPMI 1640培養(yǎng)液(含100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實驗試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)、PrimeScript RT試劑盒(日本TaKaRa公司)；Tris-Base(美國Sigma公司)、SIRT6抗體、IGF1R抗體、AKT抗體、二抗、β-actin抗體(美國Sigma公司)；SDS-PAGE試劑盒(碧云天公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)；重組腺病毒(Ad-SIRT6、GFP-SIRT6、Si-SIRT6、Si-NC)(上海漢恒公司)；TUNEL試劑盒(美國Promega公司)；CCK-8試劑盒(日本DOJINDO公司)；引物設計委托Invitrogen公司完成。

1.4 實驗方法

1.4.1 RNA提取與實時熒光定量(qPCR)檢測 采用TRIzol試劑盒提取組織和細胞中RNA，按照PrimeScript試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qRCP檢測SIRT6表達。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。反應結(jié)束后獲得熔解曲線和擴增曲線。SIRT6相對表達量以β-actin作為內(nèi)參照，SIRT6引物：上游5′-CCGGAATTCGGCTAATGTGGCAGTCCTCC-3′；下游5′-CGCGGATCCAGGTCCCGGGTCAGCTGG-3′。β-actin引物：上游5′-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′；下游5′-CCGCCAGACAGCACTGTGTT-3′。反應結(jié)束后計算每個基因的循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt進行計算，并與β-actin比較，確定SIRT6 mRNA相對表達水平。ΔCt=Ct(SIRT6)-Ct(β-actin)，ΔΔCt=ΔCt(癌組織)-ΔCt(癌旁組織)。IGF1R、AKT mRNA檢測方法同上，IGF1R引物：上游5′-GTGGGGGCTCGTGTTTCTC-3′；下游5′-GATCACCGTGCAGTTTTCCA-3′；AKT引物：上游5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′；下游5′-CT-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.4.2 Western blot檢測蛋白表達 取適當腫瘤組織和癌旁組織，剪碎后勻漿，加入裂解液200 μL裂解約30 min后，低溫離心(12000 r/min，4℃)，吸取上清液分裝。針對細胞株，所有操作均在冰上進行，原理與步驟與組織蛋白提取類似。測定蛋白質(zhì)濃度，配置8% SDS-PAGE分離膠、5% SDS-PAGE濃縮膠，取10 μL樣品上樣，80～120 V電壓下進行電泳。轉(zhuǎn)膜后加入一抗，4℃過夜。加入二抗(1∶5000稀釋)后，37℃搖床中孵育1.5 h，進行發(fā)光顯影掃描記錄數(shù)據(jù)。

1.4.3 調(diào)節(jié)A549細胞SIRT6表達 Ad-SIRT6是SIRT6過表達載體、GFP-SIRT6是Ad-SIRT6對照空載體、Si-SIRT6是SIRT6干擾載體、Si-NC是Si-SIRT6對照空載體。將A549細胞分為4組，分別用上述載體進行感染，并設置為過表達組(Ad-SIRT6)及其對照組(GFP-SIRT6)、干擾組(Si-SIRT6)及其對照組(Si-NC)。選取對數(shù)期生長良好的A549細胞，經(jīng)消化后接種于6孔板中，使每孔細胞數(shù)為1×105～2×105個，向每孔中加入RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度達到50%～70%時，加入已經(jīng)擴增好的腺病毒上清1 mL，繼續(xù)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用。同時設置16HBE細胞干擾組進行對照。SIRT6上游：5′-GATCCGGTCTGGCAGT-CTTCCAGTGTTTCAAGAGAACACTGGAAG-ACTGCCAGACCTTTTTTG-3′，下游：5′-GCC-AGACCGTCAGAAGGTCACAAAGTTCTCTT-GTGACCTTCTGACGGTCTGGAAAAAAACT-TAA-3′；Si-SIRT6上游：5′-GCCGUCUGGUUGUCAATT-3′，下游：5′-UUGACAAUGAGACGG-CTT-3′。

1.4.4 細胞增殖實驗 用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖，將轉(zhuǎn)染的細胞接種于96孔板(2×103個細胞/孔)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測前2 h向每孔中加入10 μL CCK-8試劑(5 mg/mL)；分別于培養(yǎng)12、24、36、48 h后采用酶標儀檢測450 nm處吸光度值(A值)。

1.4.5 細胞凋亡實驗 細胞培養(yǎng)48 h后，采用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡，收集細胞，PBS洗滌1次后，4%多聚甲醛溶液固定45 min，再次PBS洗滌，0.1% Triton X-100+PBS重懸細胞，冰浴2 min，加入50 μL TUNEL檢測液，37℃下避光孵育45 min，PBS洗滌后，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況并計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 SIRT6在NSCLC組織和細胞中的表達

癌組織SIRT6 mRNA相對表達量(0.289±0.187)明顯低于癌旁組織(0.967±0.282)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=6.941，P<0.01)，詳見圖1A；SIRT6蛋白相對表達量(0.433±0.089)明顯低于癌旁組織(1.067±0.106)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=15.868，P<0.01)，詳見圖1B；A549中，SIRT6 mRNA相對表達量(0.373±0.092)明顯低于16HBE(1.012±0.183)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=6.976，P<0.01)，詳見圖1C；SIRT6蛋白相對表達量(0.383±0.092)明顯低于癌旁組織(1.037±0.116)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.877，P<0.01)，詳見圖1D。

A：癌組織、癌旁組織SIRT6 mRNA相對表達量；B：癌組織、癌旁組織SIRT6蛋白相對表達量；C：A549、16HBE SIRT6 mRNA相對表達量；D：A549、16HBE SIRT6蛋白相對表達量；**P<0.01圖1 SIRT6在NSCLC組織和細胞中的表達Fig.1 SIRT6 expression in NSCLC tissues and cells

2.2 重組腺病毒感染A549細胞對SIRT6蛋白表達的影響

構(gòu)建A549細胞過表達組(Ad-SIRT6)及其對照組(GFP-SIRT6)、干擾組(Si-SIRT6)及其對照組(Si-NC)，同時選取16HBE細胞(Si-SIRT6-16HBE組)作為對照。Western blot檢測各組細胞SIRT6蛋白表達情況，詳見圖2A。以β-actin條帶為參照，進一步分析結(jié)果顯示，Ad-SIRT6組SIRT6蛋白表達高于其他各組，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，可以進行后續(xù)研究，詳見圖2B。

2.3 SIRT6對細胞生物學功能的影響

CCK-8法檢測細胞增殖，結(jié)果顯示，24、36、48 h時，Ad-SIRT6組細胞增殖能力明顯低于Si-SIRT6組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Si-SIRT6-16HBE組細胞增殖能力明顯高于Si-NC-16HBE組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。這一結(jié)果說明，SIRT6可抑制A549、16HBE細胞增殖能力，詳見圖3。

①：Si-SIRT6；②：Si-SIRT6-16HBE；③：Ad-SIRT6；④：Si-NC-16HBE；⑤：GFP-SIRT6；⑥：Si-NC； *P<0.05圖2 重組腺病毒感染A549細胞對SIRT6蛋白表達的影響Fig.2 Effect of recombinant adenovirus-infected A549 cells on the expression of SIRT6 protein

Ad-SIRT6組與Si-SIRT6組比較,a P<0.01；Si-SIRT6-16HBE組與Si-NC-16HBE組比較,b P<0.01圖3 SIRT6對A549、16HBE細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of SIRT6 on proliferation of A549 and 16HBE cells

2.4 細胞凋亡情況

Ad-SIRT6組凋亡細胞數(shù)明顯高于Si-SIRT6組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Si-SIRT6-16HBE組凋亡細胞數(shù)明顯高于Si-NC-16HBE組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見圖4。

A：Ad-SIRT6組；B：Si-SIRT6組；C：Si-SIRT6-16HBE組；D：Si-NC-16HBE組；**P<0.01圖4 SIRT6對A549、16HBE細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of SIRT6 on apoptosis of A549 and 16HBE cells

2.5 SIRT6對A549細胞IGF1R、AKT表達影響

由于IGF1R可通過調(diào)控其下游AKT表達，進而發(fā)揮抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖的作用，并且，如前所述，SIRT6與IGF1R、AKT關(guān)系密切。因此，為了探討干擾/過表達SIRT6對A549細胞IGF1R、AKT表達的影響，此部分選取A549細胞(設置為Mock組)作為對照進行研究。結(jié)果顯示，Si-SIRT6組IGF1R、AKT mRNA和蛋白均明顯高于Mock組和Ad-SIRT6組，而上調(diào)SIRT6的Ad-SIRT6組，其IGF1R、AKT mRNA和蛋白均明顯低于其余兩組(均P<0.01)。說明與未進行干擾/過表達的A549細胞相比，下調(diào)SIRT6可增加A549細胞IGF1R、AKT表達，反之，上調(diào)SIRT6能降低A549細胞IGF1R、AKT表達，詳見圖5。

**P<0.01圖5 SIRT6對A549細胞IGF1R、AKT表達的影響Fig.5 Effect of SIRT6 on expression of IGF1R，AKT proteins in A549 cells

3 討論

人類與沉默信息調(diào)節(jié)因子家族密切相關(guān)的蛋白有7個，分別是SIRT1～SIRT7，它們在細胞中定位不同，發(fā)揮著不同的作用，但均與衰老和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。新近研究表明，SIRT6廣泛參與衰老、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA加工等生物學過程[11]。在腫瘤的形成和發(fā)展過程中，SIRT6發(fā)揮著重要作用。Sebastián等[12]在一項臨床樣本分析中指出，SIRT6在腫瘤細胞中通過調(diào)控糖酵解發(fā)揮抑癌作用。Zhang等[13]和Zhang等[14]在同年分別從不同的角度報道了SIRT6表達水平與卵巢癌分化程度和卵巢癌患者預后明顯相關(guān)。有趣的是，SIRT6在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中同時扮演著癌基因和抑癌基因雙重角色[5，15]。在NSCLC方面，Han等[16]的研究顯示，癌組織中SIRT6的表達明顯低于正常組織，其機制可能與SIRT6抑制上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)轉(zhuǎn)錄因子Twist 1的表達進而抑制NSCLC細胞增殖有關(guān)。而也有研究認為，SIRT6降解的增加，會提高肺癌對放療的敏感性，降低SIRT6會增加肺腺癌對化療的敏感[17-18]。由此可見，SIRT6在眾多腫瘤的發(fā)生過程中均起著重要的作用，但作用卻不盡相同，作用機制較為復雜。

本研究結(jié)果顯示，癌組織SIRT6 mRNA、SIRT6蛋白相對表達量明顯低于癌旁組織，同時，A549 SIRT6 mRNA、SIRT6蛋白相對表達量也明顯低于16HBE。這說明，在NSCLC中，SIRT6可能起著抑癌基因的作用。為了進一步驗證這一結(jié)果，本研究進行了細胞學水平的分析，在構(gòu)建干擾/過表達SIRT6細胞后，利用CCK-8法檢測細胞增殖，利用TUNEL法檢測細胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾表達SIRT6的細胞增殖能力明顯高于過表達組的細胞，過表達SIRT6的細胞凋亡數(shù)明顯高于干擾表達組的細胞。這一結(jié)果說明，SIRT6具有抑制A549細胞增殖，促進A549細胞凋亡的作用。

眾多研究證實，IGF1R是PI3K-AKT的上游調(diào)控分子，參與細胞的代謝、增殖和凋亡[19]。本研究通過觀察IGF1R、AKT表達情況，以探討SIRT6在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達SIRT6的A549細胞，其IGF1R、AKT mRNA和蛋白水平均明顯低于干擾表達組。這提示，SIRT6可下調(diào)IGF1R、AKT表達。結(jié)合前面的研究結(jié)果，我們推測，SIRT6可抑制IGF1R-AKT通路活化，進而發(fā)揮其抑癌基因的作用，這將為研究NSCLC早期診斷及靶向治療提供初步的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，SIRT6在NSCLC組織和細胞中呈現(xiàn)低表達，SIRT6可能通過抑制IGF1R/AKT信號通路的異?；罨?，阻止A549細胞的增殖，促進A549細胞的凋亡。但是本研究僅提出了SIRT6、IGF1R、AKT在調(diào)節(jié)NSCLC生物學功能中的可能性，由于SIRT6具有極為復雜的功能，因此具體調(diào)控機制及其調(diào)控過程中是否有其他靶基因參與仍需要進一步證實。