(西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650224)

十里香茶是栽培型茶樹(shù)，屬山茶科、茶屬、茶種(Camellasinensis(L.) O.Ktze.cv.Kunming Shilixiang)，是一種稀有的中小葉、高香型茶樹(shù)品種，并且具有較強(qiáng)的抗寒旱、抗病蟲(chóng)、耐貧瘠能力[1]。十里香又名“十里貢茶”，是云南歷史悠久、文化內(nèi)涵豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的傳統(tǒng)高端綠茶，其口感滋味醇和香氣濃郁，曾在“2011世界綠茶評(píng)比大會(huì)”獲得金獎(jiǎng)。由于革命戰(zhàn)火和城市建設(shè)等，十里香茶曾歷經(jīng)多次衰敗甚至險(xiǎn)遭滅絕，現(xiàn)今雖恢復(fù)有200畝種群基地，但約半數(shù)為新植幼苗，發(fā)展較為薄弱[2]。通過(guò)對(duì)十里香茶進(jìn)行離體快繁，可使其珍貴優(yōu)良的品種資源、高端稀缺的品質(zhì)資源以及傳統(tǒng)名茶的品牌資源得到充分的保護(hù)和發(fā)展。與扦插等方式相比，植物離體組培可在材料有限的情況下，不受地理、氣候環(huán)境條件的限制，就能實(shí)現(xiàn)十里香茶高效快速地大量繁殖[3-4]，是一種保存和交換其種質(zhì)資源的有效方式，也是對(duì)其新品種培育、生物學(xué)基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的不間斷的物質(zhì)基礎(chǔ)和來(lái)源[5-6]。因此通過(guò)離體培養(yǎng)建立再生體系是解決十里香茶樹(shù)產(chǎn)量繁殖、種質(zhì)保護(hù)及交流、遺傳改良的一種有效途徑。

目前國(guó)內(nèi)外在茶樹(shù)組織與器官培養(yǎng)方面發(fā)展迅速，可通過(guò)茶樹(shù)莖尖、腋芽、莖段、葉片、子葉、胚和花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織或產(chǎn)生不定芽的方式獲得完整的再生植株[7-9]。由于茶樹(shù)自身富含的酚類(lèi)化合物易氧化導(dǎo)致外植體褐變壞死以及自身攜帶較多內(nèi)生菌易導(dǎo)致外植體污染的原因，使得茶樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中主要存在著外植體易污染、褐化的難題[10-11]。所以本研究擬通過(guò)選取十里香茶不同外植體材料、消毒時(shí)間、光照條件以及培養(yǎng)基添加物的方法，得到低污染效果的同時(shí)，減輕十里香茶樹(shù)外植體褐化的情況，并確定適宜的生根培養(yǎng)基，從而完成十里香茶由田間腋芽到完整無(wú)菌組培苗的過(guò)程，為后續(xù)工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料為西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園種植的十里香茶樹(shù)，樹(shù)齡約50年，于2018年10月采集健壯、無(wú)病蟲(chóng)害枝條上的帶有腋芽的莖段。為比較不同幼嫩程度的外植體的褐化情況，選取了輕微木質(zhì)化的帶芽莖段和完全幼嫩的帶芽莖尖2種材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體預(yù)處理及消毒

將采回的外植體先用自來(lái)水持續(xù)沖洗2 min，再用8 g·L-1多菌靈溶液浸泡20 min，然后用自來(lái)水持續(xù)沖洗45 min，接著放入無(wú)菌水中低溫(4 ℃)處理12 h。

本次實(shí)驗(yàn)升汞溶液的不同清洗時(shí)間設(shè)置為10、15、20 min，在超凈操作臺(tái)以每5棵外植體作為單組進(jìn)行1次消毒，先用75%的酒精浸泡30 s，然后在無(wú)菌水中清洗4次，接著使用0.1 g·L-1升汞溶液洗滌，浸泡過(guò)程中不斷搖晃，之后進(jìn)行8次無(wú)菌水洗滌，最后接種到培養(yǎng)基。

1.2.2腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)

將上述消毒處理的外植體材料分別接種于培養(yǎng)基MS+0.2 mg·L-1萘乙酸(NAA)+6 mg·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+3 000 mg·L-1活性炭(AC)+3.0%蔗糖、0.7%瓊脂(pH=5.6)上，于接種7 d統(tǒng)計(jì)消毒時(shí)間對(duì)外植體污染率和褐化率的影響，篩選出消毒最佳條件。

污染率(%)=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%；

褐化率(%)=(褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%)。

另外，將以最佳消毒處理的外植體分別接種于含有不同PVP(3，6，9，12 mg·L-1)、AC(1 000，2 000，3 000，4 000 mg·L-1)和維生素C(Vc)(500，1 000，1 500，2 000 mg·L-1)濃度組合的培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基上(附加0.2 mg·L-1NAA)，于接種30 d統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基對(duì)腋芽生長(zhǎng)及外植體褐化的影響。

同時(shí)，將上述消毒外植體分別接種于不同光照處理的培養(yǎng)基MS+0.2 mg·L-1萘乙酸(NAA)+6 mg·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+3 000 mg·L-1活性炭(AC)+3.0%蔗糖、0.7%瓊脂(pH=5.6)上，于光照培養(yǎng)7 d后觀察統(tǒng)計(jì)不同光照條件對(duì)褐化率的影響。光照培養(yǎng)條件分別為：

1) 5 d暗培養(yǎng)+12 h強(qiáng)光照(2 000～3 000 Lx)培養(yǎng)；

2) 連續(xù)12 h強(qiáng)光照(2 000～3 000 Lx)培養(yǎng)；

3) 連續(xù)12 h弱光照(750～1 500 Lx)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，濕度為70%～80%。

1.2.3不定芽生根誘導(dǎo)

將污染和褐化得到有效控制且生長(zhǎng)狀況良好的外植體接種到MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS，附加1 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)，觀察生根數(shù)，出現(xiàn) 2 條以上視為有效根，于第30天統(tǒng)計(jì)生根率。

生根率(%)=(生根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對(duì)外植體褐化程度的影響

2.1.1消毒時(shí)間對(duì)外植體褐化的影響

結(jié)果表明，消毒10 min褐化率最低，為31.11%，但污染率高至45.55%，而進(jìn)行20 min消毒污染率減低為24.44%，褐化率卻升高至72.22%(表1)，莖葉明顯完全褐化。消毒時(shí)間15 min，污染率25.56%，褐化率40%，莖葉少有褐化現(xiàn)象，外植體生長(zhǎng)良好，是能控制污染和褐化問(wèn)題的最佳消毒處理時(shí)間。

表4 含不同抗褐化劑的培養(yǎng)基褐化及生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)

培養(yǎng)基編號(hào)不同抗褐化劑濃度/(mg·L-1)VcPVPAC褐化率/%外植體生長(zhǎng)狀況150012-20.00±3.33bc++210009-23.33±6.67bc++315006-13.33±3.34bc++420003-10.00±3.33c++++510003-22.22±1.92bc++6-3400026.67±6.67bc+7-6300010.00±3.33c++++8-9200016.67±5.77bc++9-12100017.78±1.92bc++10500-300030.00±3.33b++111000-200013.33±3.34bc+++121500-100015.56±1.93bc++132000-100025.56±1.93bc++1410009200026.67±0.00bc+1510009300021.11±1.92bc++1610009400012.22±1.92bc++ck---78.89±1.92a+

注：表中“+”越多表示生長(zhǎng)狀況越好。

表1 不同消毒時(shí)間處理后的外植體第7天褐化率及污染率統(tǒng)計(jì)

消毒時(shí)間/min污染率/%褐化率/%1045.55±3.85a31.11±5.09b1525.56±1.93a40.00±3.33a2024.44±5.09b72.22±1.92a

注：表中同列數(shù)據(jù)的不同大小寫(xiě)字母表示在0.05 水平有差異顯著性。下同。

2.1.2不同幼嫩程度的外植體的褐化情況

在確定升汞消毒時(shí)間為15 min后，觀察不同幼嫩程度外植體的褐化情況。發(fā)現(xiàn)輕微木質(zhì)化的材料褐化程度遠(yuǎn)小于完全幼嫩材料的褐化程度。完全幼嫩的外植體，于2 d后褐化趨于嚴(yán)重，第7天褐化率高達(dá)73.33%(表2)，材料幾乎已完全褐化，而輕微木質(zhì)化的外植體呈現(xiàn)健康的綠色，少有褐化。

表2 不同幼嫩程度的外植體第7天褐化率統(tǒng)計(jì)

外植體幼嫩情況褐化率/%輕微木質(zhì)化20.00±3.33完全幼嫩73.33±6.67

2.1.3不同光照條件對(duì)外植體褐化的影響

全程光周期培養(yǎng)的外植體在2～3 d后開(kāi)始呈現(xiàn)不同程度的褐變，而經(jīng)過(guò)5 d暗培養(yǎng)的材料少有褐化現(xiàn)象并生長(zhǎng)良好，褐化率為28.89%(表3)，未經(jīng)過(guò)暗培養(yǎng)的材料褐化率分別高至67.78%和51.11%，外植體基本已完全褐化。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)情況的影響

經(jīng)過(guò)4周的觀察發(fā)現(xiàn)，不同配比的添加物對(duì)十里香腋芽的萌發(fā)生長(zhǎng)有顯著的影響。由表4可知，未添加任何抗褐化劑的ck培養(yǎng)基因褐化率過(guò)高，外植體無(wú)顯著生長(zhǎng)變化；而使用抗褐化劑的培養(yǎng)基褐化率均可降低至27%以下，外植體均有不同程度的生長(zhǎng)變化。其中，4號(hào)2 000 mg·L-1Vc+3 mg·L-1PVP和7號(hào)6 mg·L-1PVP+3 000 mg·L-1AC的培養(yǎng)基中外植體萌發(fā)力強(qiáng)，生長(zhǎng)狀況最優(yōu)，且褐化率為最低值10%，并且再經(jīng)過(guò)2周的觀察發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)勢(shì)一直保持最優(yōu)，外植體呈健康綠色，莖葉生長(zhǎng)粗壯，是十里香腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)最理想的培養(yǎng)基。11號(hào)(1 000 mg·L-1Vc+2 000 mg·L-1AC)的培養(yǎng)基褐化率13%，萌發(fā)力足,生長(zhǎng)狀況良。3號(hào)和16號(hào)培養(yǎng)基的褐化率雖然保持在較低范圍，但是外植體卻生長(zhǎng)緩慢，萌發(fā)力弱，長(zhǎng)勢(shì)不明顯，不利于實(shí)驗(yàn)的后續(xù)進(jìn)行。另外，高濃度的AC和低濃度的PVP搭配的6號(hào)培養(yǎng)基，以及3種抗褐化劑均搭配的14號(hào)培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況也不理想，不能促進(jìn)十里香腋芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)。

表3 不同光照條件的外植體第7天褐化率統(tǒng)計(jì)

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽生根的影響

本實(shí)驗(yàn)將污染和褐化得到良好控制的外植體接種于不同濃度的MS培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)連續(xù)30 d的觀察，發(fā)現(xiàn)不同濃度的MS培養(yǎng)基影響外植體的生根能力。MS濃度越低，外植體生根率越高，且根長(zhǎng)越長(zhǎng)。1/8 MS培養(yǎng)的外植體根的增長(zhǎng)速度最快，生根率為80%，根長(zhǎng)2.6 cm(表5)，其根粗壯且長(zhǎng)，1/4 MS次之，其次為1/2 MS，根增長(zhǎng)速度最慢且根長(zhǎng)最短的為MS培養(yǎng)基，其生根率為33.33%，根長(zhǎng)0.5 cm，根細(xì)弱短小。

3 結(jié)論與討論

正常情況下增加外植體消毒的時(shí)間雖然會(huì)降低污染率，但褐化現(xiàn)象會(huì)加重[12-13]，鄔秀宏等[14]在升汞消毒6 min時(shí)將外植體的污染率和褐化率保持在50%和57%，而本實(shí)驗(yàn)對(duì)外植體進(jìn)行多菌靈浸泡和低溫預(yù)處理后，升汞溶液消毒15 min可以將污染率和褐化率降至26%和40%，所以對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理可以有效減少污染和褐化的發(fā)生。腋芽是茶樹(shù)離體組培中較有效的材料，具有更高的繁殖率和穩(wěn)定的遺傳特性[15-17]；新梢旺盛生長(zhǎng)期到新梢半木質(zhì)化期的材料所含細(xì)菌少，生活力和分化能力較強(qiáng)，所以選擇合適的材料也能減少褐化的發(fā)生[18-19]。本實(shí)驗(yàn)選取的秋季萌發(fā)的輕微木質(zhì)化腋芽對(duì)酒精和升汞溶液的傷害抵抗作用更強(qiáng)一些，在經(jīng)過(guò)一系列洗滌消毒后，幼嫩外植體因抵抗能力弱在消毒過(guò)程中易受到傷害而導(dǎo)致不能正常生長(zhǎng)[20]，所以完全幼嫩的腋芽容易受損傷而褐變，褐化程度明顯比輕微木質(zhì)化的腋芽高。后續(xù)可選取春季萌發(fā)的十里香茶腋芽進(jìn)行研究，篩選出茶樹(shù)組培更低污染及褐化率的外植體材料。對(duì)于不同光照條件下，暗培養(yǎng)5 d的材料褐化少有發(fā)生，是由于在無(wú)光條件下材料處于能降低多酚氧化酶活性的環(huán)境不適合合成酚類(lèi)物質(zhì)，從而減輕了材料的褐化[21]。

表5 不同濃度的MS培養(yǎng)基對(duì)無(wú)菌苗生根的影響

注：表中“+”越多表示增長(zhǎng)速度越快。

鄔秀宏等[14]將茶樹(shù)外植體接種在MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1 mg·L-1GA3+ 0.02 g·L-1核黃素的培養(yǎng)基時(shí)褐化率為13.3% ；雷攀登[21]單獨(dú)添加PVP、AC、Vc時(shí)可以分別將褐化率降低至21.3%、30.8%、26.5%。而本實(shí)驗(yàn)得出十里香茶樹(shù)生長(zhǎng)最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+ 0.2 mg·L-1NAA+2 000 mg·L-1Vc+3 mg·L-1PVP或MS+0.2 mg·L-1NAA+3 000 mg·L-1AC+ 6 mg·L-1PVP，可以將褐化率降為10%，說(shuō)明PVP、AC、Vc作為抗褐化劑組合使用時(shí)的效果較為明顯。劉海龍等[22]通過(guò)添加不同濃度激素和芽的不同剪切方式進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了澳洲茶樹(shù)組培中增殖周期、增殖倍數(shù)、有效芽數(shù)等指標(biāo)，降低了組培產(chǎn)業(yè)化育苗的成本，后期可參考類(lèi)似方法進(jìn)一步篩選出十里香茶樹(shù)高效的繼代增殖技術(shù)，以滿足低成本、大規(guī)模、高效率、長(zhǎng)時(shí)間地生產(chǎn)十里香茶。生根培養(yǎng)是離體快繁中的重要階段，生根率和根的狀態(tài)直接影響苗木的栽培成活率[23]，本實(shí)驗(yàn)得出最利于十里香茶生根的培養(yǎng)基為1/8濃度MS附加1 mg·L-1IBA。IBA和NAA均廣泛用于生根調(diào)節(jié)，孫紫薇[24]使用0.1 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-1IBA可使藤茶組培苗生根率達(dá)到86.7%；謝恩俊[25]采用50 mg·L-1IBA浸泡組培苗基部5 min后再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中的方法，可使中黃1號(hào)茶組培苗根呈輻射狀生長(zhǎng)、側(cè)根多，顏色翠綠。本研究中篩選最優(yōu)生根培養(yǎng)的條件較單一，后期有待對(duì)十里香茶樹(shù)生根條件作進(jìn)一步優(yōu)化。另外組培苗的煉苗和移栽也是工廠化育苗的一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)，吳麗君等[26]篩選出V黃心土∶V蛭石= 3∶1的基質(zhì)可使金花茶組培苗移栽成活率高達(dá)94%，后續(xù)可結(jié)合不同煉苗時(shí)間與不同配比的基質(zhì)得到適合十里香茶煉苗和移栽的條件，確定出一條完整的十里香茶樹(shù)離體再生規(guī)?；绲纳a(chǎn)線。

通過(guò)本研究方法離體培養(yǎng)的十里香茶的健壯無(wú)菌組培苗，可作為十里香茶種質(zhì)資源保護(hù)以及異地種質(zhì)資源交流，也能加深茶學(xué)研究的深度和擴(kuò)大品種選育的廣度。后續(xù)為保護(hù)其他名古茶樹(shù)種質(zhì)資源以及建立其快繁體系組培苗化提供指導(dǎo)，使其得到產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用，成為能高效穩(wěn)定保存和保護(hù)我國(guó)優(yōu)良古茶樹(shù)品種種質(zhì)資源的方法。