馬廷娟，原 野，林凱青，南 蓬，盧寶榮

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS)是所有植物和大部分微生物體內(nèi)莽草酸途徑的一個關(guān)鍵酶，在芳香族氨基酸的生物體合成中至關(guān)重要[1].此外，EPSPS還參與植物許多次生代謝物的合成，包括黃酮類化合物、細(xì)胞色素、生長激素等[2].當(dāng)EPSPS的合成受阻或EPSPS被降解，植物的生長發(fā)育就會受到影響甚至死亡.草甘膦是許多除草劑中的有效活化學(xué)成分，可以競爭性抑制EPSPS活性，從而導(dǎo)致植物生長受阻，甚至死亡[3]，這就是草甘膦作為一種廣譜性除草劑的作用機(jī)理.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物的成功培育和商品化應(yīng)用，使農(nóng)作物產(chǎn)生了抗該除草劑的能力，因此在除草劑選擇壓下農(nóng)作物能正常生長，但與此同時(shí)雜草會被除滅，提高了農(nóng)作物的生產(chǎn)效率.

在眾多利用EPSPS基因來提高草甘膦抗性的策略中[4-6]，過量表達(dá)植物內(nèi)源EPSPS基因就是有效的策略之一[7-9].通過過量表達(dá)來自栽培稻(水稻，Oryzasativa)的內(nèi)源EPSPS基因，育種家培育出的轉(zhuǎn)基因水稻品系，具有抗草甘膦除草劑的能力[7-9].然而，轉(zhuǎn)基因水稻品種中過量表達(dá)的EPSPS基因通過花粉介導(dǎo)漂移到野生近緣種中，是否會帶來潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，成為公眾關(guān)注的生物安全問題[10].前人在對過量表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因水稻與雜草稻雜種分離后代的安全評價(jià)中發(fā)現(xiàn)，在不施用草甘膦除草劑的情況下，不同組合中含有EPSPS轉(zhuǎn)基因的雜種后代(F3)群體，其光合速率均顯著高于不含轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖后w，表明過量表達(dá)EPSPS基因能顯著提高雜種后代的光合作用速率[11].

光合作用在植物生長發(fā)育過程中具有非常重要的作用，而且光合作用的速率受到許多因素調(diào)節(jié).光合作用除了受光系統(tǒng)對光能的捕捉等因素的影響之外[12]，葉綠素的含量與光合作用的速率也密切相關(guān).研究表明，在一定的范圍內(nèi)，葉綠素的含量越高，光合速率越高，反之亦然[13].因此，在過量表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因水稻與雜草稻雜種后代中觀察到的光合速率增加現(xiàn)象，是否與葉綠素含量的增加有關(guān)？非常值得探究.這些研究的結(jié)果，可以幫助我們從葉綠素合成途徑整個通路的角度，來解析過量表達(dá)EPSPS基因與光合作用速率增加的關(guān)系，包括在葉綠素合成途徑中哪些關(guān)鍵基因的表達(dá)量發(fā)生了變化，進(jìn)而影響葉綠素含量的增加(圖1).

由圖1可以看出，有3個基因，即GLUTR(谷氨酰-tRNA還原酶合成基因)、CHLH(鎂螯合酶亞基CHLH合成基因)以及PORA(原葉綠素酸酯還原酶A合成基因)在葉綠素合成通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這已經(jīng)得到了大量研究的證實(shí)[14-16].EPSPS基因的過量表達(dá)是否會導(dǎo)致這3個基因的表達(dá)量發(fā)生變化也是亟待回答的問題.

通過乙醇浸提和紫外分光光度相結(jié)合的方法，可以測定目標(biāo)植物葉片中葉綠素的含量[17]，而通過熒光定量PCR(qPCR)的方法，可以分析測定植物體中目標(biāo)基因的相對表達(dá)量[18].對葉綠素含量的檢測和基因表達(dá)量的檢測，都已經(jīng)有了成熟的方法.通過對含有過量表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因的雜種后代群體，與其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖后w的葉綠素含量和葉綠素合成關(guān)鍵基因進(jìn)行比較，就可以明確回答上述問題.

因此本研究的主要目的： (1) 以過量表達(dá)EPSPS的轉(zhuǎn)基因栽培稻與雜草稻雜種F3代分離群體為材料，檢測含轉(zhuǎn)基因群體的葉綠素含量是否比非轉(zhuǎn)基因群體有所增加；(2) 檢測含轉(zhuǎn)基因群體的葉綠素合成3個關(guān)鍵基因(GLUTR，CHIH，PORA)相對表達(dá)量是否比非轉(zhuǎn)基因群體有所增加.上述科學(xué)問題的解答有助我們進(jìn)一步理解EPSPS的過量表達(dá)為什么會導(dǎo)致光合速率的增加，以及其它適合度相關(guān)性狀都有不同程度加強(qiáng)的原因.同時(shí)，也為進(jìn)一步研究莽草酸途徑中EPSPS的增加如何影響光合速率的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所選用的材料是轉(zhuǎn)基因栽培稻和雜草稻雜交分離F3代分離群體，包括兩個雜交組合的EPSPS轉(zhuǎn)基因(WH1++和WH2++)和兩個非EPSPS轉(zhuǎn)基因純合(WH1--和WH2--)群體.其中栽培稻是轉(zhuǎn)基因栽培稻品系為EP3，雜草稻是來源于越南的W1和來源于韓國的W2[11].栽培稻品系EP3由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.EP3中含有1個由中科院朱禎實(shí)驗(yàn)室分離自栽培稻(Minghui-W2)的內(nèi)源基因EPSPS[9].EP3的獲得過程是： 通過在同一個表達(dá)載體P1300上構(gòu)建潮霉素抗性標(biāo)記基因HPT和基因EPSPS并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化明恢86(MH-86)而得，控制EPSPS基因和標(biāo)記基因HPT的啟動子分別為Ubiquitin啟動子和35S啟動子[11].

WH1和WH2的獲得過程為，將雜草稻W(wǎng)1和W2作為母本，EP3作為父本分別進(jìn)行人工雜交，獲得了2個雜交組合并含轉(zhuǎn)基因的F1雜種(轉(zhuǎn)基因雜合，WH1+-和WH2+-).將雜種F1進(jìn)行自交分離，并通過轉(zhuǎn)基因分子檢測，分別獲得含轉(zhuǎn)基因(包括轉(zhuǎn)基因雜合體和純合體)或不含轉(zhuǎn)基因的F2代群體；進(jìn)一步對F2分離群體進(jìn)行鑒定和篩選，獲得遺傳背景一致而包含EPSPS轉(zhuǎn)基因(WH1++和WH2++，轉(zhuǎn)基因陽性)和不含EPSPS轉(zhuǎn)基因(WH1--和WH2--，轉(zhuǎn)基因陰性)的純合F3代群體，進(jìn)行葉綠素含量測定和葉綠素合成途徑基因的qPCR實(shí)驗(yàn)(表1).

表1 本研究的實(shí)驗(yàn)材料和描述

前期利用RT-PCR、qPCR以及ELISA這3種不同的方法，均確認(rèn)了所用實(shí)驗(yàn)材料的轉(zhuǎn)基因陽性群體中EPSPS的表達(dá)量以及EPSPS蛋白的含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因陰性群體[11].

1.2 方法

1.2.1EPSPS轉(zhuǎn)基因陽性和陰性實(shí)驗(yàn)材料的鑒定

實(shí)驗(yàn)前需要將構(gòu)建的栽培稻和雜草稻轉(zhuǎn)基因雜種純合后代群體和非轉(zhuǎn)基因雜種純合后代群體，用EPSPS基因特異性引物通過PCR進(jìn)行篩選(正向引物： 5′-GTGGCTTCCTGGAGAGTAAAG-3′，反向引物： 5′-GTTCCTGACGAAAGTGCTTAGA-3′)，確保本研究的材料嚴(yán)格分離為含有轉(zhuǎn)基因EPSPS和不含轉(zhuǎn)基因EPSPS群體.轉(zhuǎn)基因陰陽性鑒定實(shí)驗(yàn)第一步要采用改進(jìn)后的CTAB法提取葉片的總DNA[19].

在栽培稻和雜草稻轉(zhuǎn)基因雜種后代中，利用EPSPS基因特異性引物能通過PCR反應(yīng)在轉(zhuǎn)基因陽性群體中擴(kuò)增出兩條帶： 一條片段長度約為425bp，是水稻自身已有的EPSPS基因條帶，另一條為轉(zhuǎn)入的EPSPS基因條帶，該外源基因不含內(nèi)含子，故其擴(kuò)增片段長度約為279bp.PCR反應(yīng)使用的20μL反應(yīng)體系中含有2×Reaction Mix 10μL，模板DNA 2μL，前后引物各1μL，Golden DNA Polymerase 0.2μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃變性5min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，重復(fù)循環(huán)35次；最后72℃延伸7min.PCR擴(kuò)增使用ABI公司2720 PCR熱循環(huán)儀.實(shí)驗(yàn)中所用的2×Reaction Mix、Golden DNA Polymerase使用天根生化有限公司的產(chǎn)品，于生工生物工程(上海)有限公司合成所用引物.1.2%濃度的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳，電泳后于紫外線下觀察用溴化乙錠(EB)染色的膠.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及取樣

本實(shí)驗(yàn)首先在黑暗環(huán)境下萌發(fā)不同來源的雜種后代組合.種子露白后移到光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10d，鑒定好轉(zhuǎn)基因陰陽性之后移幼苗至溫室培養(yǎng)，種植于預(yù)先填滿土的50cm×40cm×15cm的塑料盆中.4組實(shí)驗(yàn)材料作為4個處理，每個處理按5行×4列的格局種植20株個體.總共有12個小區(qū)，每個處理分別重復(fù)種植于3個小區(qū)，每兩個單株的間距設(shè)為5cm.保證溫室溫度在20～30℃之間(溫度低于該范圍時(shí)，采用人工照明光源對光照進(jìn)行補(bǔ)償).其中30d的材料同時(shí)測量了親本(EP3和MH-86)作為對照.

實(shí)驗(yàn)材料選取兩個時(shí)期，30d和60d.取樣時(shí)，每種栽培稻和雜草稻轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因雜種后代各選取30株，每個小區(qū)選取10株，剪去根部，稱取植株根上部分鮮重m(g).選取5株實(shí)驗(yàn)材料混樣作為一個樣本，每種雜種后代群體重復(fù)取樣6次.

1.2.3 葉綠素含量測定

采用混合液浸提法提取葉綠體色素.取水稻(培養(yǎng)30d和60d)根以上相同位置的葉片0.1g，剪成4～8mm的葉條，放入具塞試管中，加入混合提取液(丙酮∶乙醇=1∶1體積比混勻)至刻度，置暗箱中直接浸提葉綠體色素約48h，其間振搖2～3次，直至碎片完全變白為止[17].綠色溶液經(jīng)準(zhǔn)確定容，澄清后用NanoDrop2000c超微量紫外分光光度計(jì)分別于645nm、663nm波長下測定吸光度，計(jì)算得到葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素平均含量(mg/g)[20].以葉綠素平均含量乘以每株地上部分鮮重m(g)，估算每個植株葉綠素總量(mg).

1.2.4 基因表達(dá)量測定

本研究使用GeneMark Total RNA Purification Kit總RNA提取試劑盒TR01提取新鮮水稻植株中的總RNA.使用天根Quant cDNA第一鏈合成試劑盒KR-103，以新鮮水稻植株葉片總RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄合成其第一鏈cDNA.

反轉(zhuǎn)錄PCR完成后，將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行普通PCR驗(yàn)證，以實(shí)驗(yàn)室常用的葉綠體rbcL基因跨CDS區(qū)特異性引物(正向引物5′-TTGGCAGCATTCCGAGTAAC-3′，反向引物5′-TTCATTACCTTCACGA GCAAGA-3′)進(jìn)行擴(kuò)增，可以植物cDNA為模板擴(kuò)增出1.2kb的特異性條帶，而不能以gDNA為模板進(jìn)行有效擴(kuò)增，因此可用于驗(yàn)證反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物的質(zhì)量.擴(kuò)增體系和程序使用PCR通用體系和程序.

表2 用于定量檢測葉綠素合成通路關(guān)鍵基因表達(dá)的引物

測定目標(biāo)基因GLUTR、CHLH和PORA相對表達(dá)量，引物見表2.使用Vazyme品牌的2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix qPCR預(yù)混液進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增反應(yīng)，對SYBR熒光表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.PCR實(shí)驗(yàn)操作方法參照Fang等[18].

本研究使用BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶系統(tǒng)軟件可繪制擴(kuò)增曲線圖，自動截取閾值對應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，并通過差值Ct法計(jì)算相對定量的表達(dá)差異(N為陽性個體中的表達(dá)量與陰性個體中的表達(dá)量之比值)：N=2-ΔΔCt.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析EPSPS轉(zhuǎn)基因?qū)υ耘嗟倦s草稻雜交后代葉綠素含量以及葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響.本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析軟件采用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 19.

2 結(jié)果與分析

2.1 EPSPS轉(zhuǎn)基因陽性和陰性實(shí)驗(yàn)材料的鑒定

利用EPSPS基因特異性引物通過PCR擴(kuò)增后電泳鑒定，結(jié)果表明： 轉(zhuǎn)基因陰性材料只有一個固有條帶(425bp)，而轉(zhuǎn)基因陽性材料有2個條帶(425bp固有條帶和279bp轉(zhuǎn)基因條帶)(圖2).

2.2 含EPSPS轉(zhuǎn)基因與不含轉(zhuǎn)基因雜種后代的葉綠素含量比較

葉綠素檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在兩個EPSPS轉(zhuǎn)基因稻與雜草稻雜交組合(WH1和WH2)的雜種F3分離群體中，含有EPSPS轉(zhuǎn)基因群體(轉(zhuǎn)基因陽性： WH1++和WH2++)在不同時(shí)期(種子萌發(fā)后30d和60d)，幼苗葉片中的葉綠素a和b的含量以及葉綠素總量均顯著高于不含EPSPS轉(zhuǎn)基因的群體(轉(zhuǎn)基因陰性： WH1--和WH2--)(圖3，圖4).

在種子萌發(fā)后生長30d的轉(zhuǎn)基因陽性(WH1++和WH2++)幼苗葉片中，葉綠素a的含量分別為0.188mg和0.116mg；而葉綠素b的含量分別為0.041mg和0.036mg.在轉(zhuǎn)基因陰性(WH1--和WH2--)幼苗葉片中，葉綠素a含量分別為0.102mg和0.101mg；而葉綠素b的含量分別為0.020mg和0.023mg(圖3).在種子萌發(fā)后生長至60d的轉(zhuǎn)基因陽性(WH1++和WH2++)幼苗葉片中，葉綠素a含量分別為7.151mg和4.900mg；而葉綠素b含量分別為2.350mg和1.580mg.轉(zhuǎn)基因陰性幼苗(WH1--和WH2--)的葉綠素a含量分別為4.132mg和3.232mg；而葉綠素b的含量分別為1.365mg和1.051mg(圖3).

在種子萌發(fā)后生長30d的轉(zhuǎn)基因陽性(WH1++和WH2++)幼苗葉片中，葉綠素總量分別為0.228mg和0.152mg，而轉(zhuǎn)基因陰性(WH1--和WH2--)幼苗的葉綠素總量分別為0.122mg 和0.124mg(圖3).在種子萌發(fā)后生長至60d的轉(zhuǎn)基因陽性(WH1++和WH2++)幼苗葉片中，葉綠素總量分別為9.500mg和6.480mg，而轉(zhuǎn)基因陰性幼苗(WH1--和WH2--)的葉綠素總量分別為5.497mg和4.283mg(圖4).

作為含有EPSPS轉(zhuǎn)基因的栽培稻雜交親本對照(EP3)，其種子萌發(fā)后生長至30d幼苗的葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總量分別為0.125mg、0.034mg和0.159mg，均顯著高于EP3的非轉(zhuǎn)基因親本栽培稻品種(MH-86)的幼苗，其葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總量分別為0.093mg、0.024mg、0.117mg(圖5，見第190頁).表明EPSPS轉(zhuǎn)基因增加了栽培稻(EP3)以及栽培稻與雜草稻雜交后代的葉綠素含量.

2.3 含轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因雜種后代葉綠素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量

熒光定量PCR檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在EPSPS轉(zhuǎn)基因栽培稻與雜草稻兩個雜交組合(WH1和WH2)的雜種F3群體中，多數(shù)含有EPSPS轉(zhuǎn)基因的分離群體(WH1++和WH2++)，其葉綠素合成的3個關(guān)鍵基因(GLUTR、PORA和CHLH)表達(dá)量顯著高于不含EPSPS轉(zhuǎn)基因的群體(WH1--和WH2--)(圖6，見第190頁).

GLUTR基因的表達(dá)量，在一個轉(zhuǎn)基因陽性群體(WH2+)中極顯著高于其轉(zhuǎn)基因陰性群體(WH2--)，而在另一個轉(zhuǎn)基因陽性群體(WH1++)中略高于其轉(zhuǎn)基因陰性群體(WH1-)，但沒有顯著差異.PORA基因的表達(dá)量，在兩個轉(zhuǎn)基因陽性(WH1++和WH2++)群體均極顯著高于其轉(zhuǎn)基因陰性(WH1--和WH2--)群體.CHLH基因的表達(dá)量，在一個轉(zhuǎn)基因陽性群體(WH2++)中顯著高于其轉(zhuǎn)基因陰性群體(WH2--)，而在另一個轉(zhuǎn)基因陽性群體(WH1++)中略高于其轉(zhuǎn)基因陰性群體(WH1--)，但沒有顯著差異.

3 討 論

本研究對葉綠素含量檢測結(jié)果顯示，與不含轉(zhuǎn)基因的栽培稻×雜草稻F3雜種后代群體(WH--，對照)相比，含有過量表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因的雜種后代分離群體(WH++)的葉綠素a和b含量以及葉綠素總量均有顯著增加.同時(shí)，也觀察到在不同組合雜種后代的分離群體中，葉綠素含量(包括總量、a和b)存在一定變異.與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，培養(yǎng)至60d的WH1組合EPSPS轉(zhuǎn)基因分離陽性群體中，葉綠素a和b的含量分別增加了73.06%和72.16%；而在WH2組合的EPSPS轉(zhuǎn)基因分離陽性群體中，葉綠素a和b的含量分別增加了51.61%和50.33%.因此，EPSPS轉(zhuǎn)基因分離群體的總?cè)~綠素的含量也隨之顯著增加.上述結(jié)果表明，過量表達(dá)EPSPS基因能夠提高栽培稻×雜草稻雜種的葉綠素的含量.

另外，作為F3雜種后代的轉(zhuǎn)基因栽培稻(EP3)親本以及培育EP3的非轉(zhuǎn)基因栽培稻親本(MH86)，它們之間的葉綠素含量差異，也呈現(xiàn)與轉(zhuǎn)基因陽性(WH++)和轉(zhuǎn)基因陰性(WH--)雜種后代相似的趨勢.這些結(jié)果均從不同的角度說明，含EPSPS轉(zhuǎn)基因的群體中葉綠素含量增加，是因過量表達(dá)的EPSPS轉(zhuǎn)基因而導(dǎo)致，并非由栽培稻×雜草稻的雜交過程所致.

上述系列結(jié)果充分說明，過量表達(dá)EPSPS基因能夠有效提高轉(zhuǎn)基因水稻與雜草稻雜種群體的葉綠素含量.因此而推論，前人觀察到的過量表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因栽培稻×雜草稻雜種后代群體光合速率的增加，可能與葉綠素含量的增加密切相關(guān).上述推論是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因陽性(WH++)和轉(zhuǎn)基因陰性(WH--)雜種F3后代群體是由相同的雜交組合分離而形成，WH++和WH--群體之間的遺傳背景一致，理論上它們的唯一差異，即是否含有過量表達(dá)的EPSPS轉(zhuǎn)基因.因此，上述結(jié)果很好地回答了我們提出的第一個問題，即過量表達(dá)EPSPS基因可提高水稻葉綠素的含量，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因雜種后代的光合速率增加[11].

根據(jù)前人研究結(jié)果，植物葉綠素含量的增加與葉綠素合成途徑中編碼關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量上升有關(guān)[14]，其中谷氨酰-tRNA還原酶基因(GLUTR)、鎂螯合酶亞基CHLH合成基因(CHLH)以及原葉綠素酸酯還原酶基因(PORA)就是編碼葉綠素合成途徑中3個關(guān)鍵酶的基因[21].我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含有過量表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因的栽培稻×雜草稻雜種后代(F3)群體，其葉綠素合成途徑中的這3個關(guān)鍵基因，即GLUTR，CHLH和PORA的表達(dá)，均顯著高于不含轉(zhuǎn)基因的對照雜種后代群體.這些研究結(jié)果明確地回答了我們的第二個問題，即EPSPS基因的過量表達(dá)會使GLUTR，CHLH和PORA這3個葉綠素合成關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)，從而提高了植株的葉綠素含量.

上述結(jié)果也合理解釋了Wang等(2014)的發(fā)現(xiàn)，即含有過量表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因的栽培稻與雜草稻雜種后代中光合速率顯著高于不含EPSPS轉(zhuǎn)基因的雜種后代，進(jìn)而導(dǎo)致總體適合度的增加[11].由圖1展示的葉綠素合成途徑，我們可以得出如下推論，在轉(zhuǎn)基因栽培稻與雜草稻雜種后代中，EPSPS基因的過量表達(dá)提高了雜種植株葉綠素合成通路上葉綠素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量，如GLUTR，CHLH和PORA基因，因而促進(jìn)了葉綠素的合成，提高了葉綠素的含量.我們檢測到的葉綠素含量增加，至少是導(dǎo)致光合作用速率提高的一種原因，植物通過提高光合作用提供了更充足的能量來源，于是就增加了轉(zhuǎn)基因雜種植株的適合度[11].

根據(jù)前人的研究結(jié)果顯示，谷氨酸是葉綠素合成途徑的前體，是調(diào)控葉綠素合成途徑的關(guān)鍵起始物質(zhì)[22]，而植物中的谷氨酸又是三羧酸循環(huán)通路中的產(chǎn)物之一，即谷氨酸由三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物α-酮戊二酸合成[23].我們初步的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示，過量表達(dá)EPSPS的轉(zhuǎn)基因陽性雜種群體，其L-谷氨酸含量高于轉(zhuǎn)基因陰性的雜種群體(數(shù)據(jù)未顯示).因此，深入研究含有過量表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因的雜種后代中L-谷氨酸的含量，以及調(diào)控谷氨酸合成基因的表達(dá)量，對于進(jìn)一步闡明葉綠素的合成機(jī)制、光合作用效率提高、以及揭示莽草酸與三羧酸循環(huán)之間的關(guān)系均具有重要的價(jià)值.通常EPSPS參與莽草酸合成途徑中分支酸的合成，并進(jìn)入下游芳香族氨基酸的合成[1].EPSPS基因過表達(dá)可以提高包括色氨酸在內(nèi)的芳香族氨基酸和生長素合成速率[18]，其下游的苯丙氨酸和酪氨酸含量的增加，會直接提高酪氨酸代謝通路下游的延胡索酸合成[24].延胡索酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)之后，會提高α-酮戊二酸以及葉綠素合成前體物質(zhì)谷氨酸的合成速率.基于上述結(jié)果我們推測，EPSPS基因的過量表達(dá)可能是通過其產(chǎn)物苯丙氨酸和酪氨酸的提高或其它途徑，加速了三羧酸循環(huán)的反應(yīng)速率，增加了α-酮戊二酸和谷氨酸合成，進(jìn)而加快了葉綠素合成并增加了光和作用的速率.這個推論還有待于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí).

一直以來，針對植物EPSPS基因的研究，主要集中于其表達(dá)產(chǎn)物EPSPS帶來的抗除草劑特性、抗逆性改變[25-28]、以及EPSPS基因在植物中的進(jìn)化等[29].極少有針對EPSPS基因過表達(dá)提高植物光合速率的研究，對其機(jī)制的研究目前尚未開展.本文首次揭示了水稻內(nèi)源EPSPS基因的過量表達(dá)，導(dǎo)致葉綠素合成速率增加以及與葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象.本研究結(jié)果從葉綠素合成的角度，很好解釋了前人在EPSPS轉(zhuǎn)基因水稻×雜草稻雜種后代(F3)中檢測到光合速率提高以及適合度性狀增強(qiáng)的現(xiàn)象，從分子層面初步揭示了EPSPS基因過表達(dá)對植物光合速率的影響的可能原因.同時(shí)，本研究還提出了新的假設(shè)，即： 在莽草酸通路中EPSPS基因的過量表達(dá)可能通過芳香族氨基酸產(chǎn)物的增加，提升三羧酸循環(huán)反應(yīng)速度和中間代謝產(chǎn)物合成，特別是增加了α-酮戊二酸和谷氨酸的合成，進(jìn)而影響葉綠素合成途徑，提高植物的葉綠素含量和光合速率.盡管這一假設(shè)仍需更多的實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證，但過量產(chǎn)生EPSPS如何通過莽草酸途徑下游芳香族氨基酸等代謝產(chǎn)物的提高，影響三羧酸循環(huán)途徑及其代謝產(chǎn)物合成，進(jìn)而提高植物光合速率這一過程的進(jìn)一步深入研究，將為揭示植物莽草酸途徑和三羧酸循環(huán)兩個重要的代謝通路的聯(lián)系奠定基礎(chǔ).同時(shí)，通過植物內(nèi)源EPSPS基因的修飾或過表達(dá)，可提高農(nóng)作物的光合作用和產(chǎn)量，這是一種提高產(chǎn)量的農(nóng)作物育種新思路，具有一定的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值.