儲(chǔ)燕萍，趙 望，劉思秀

(1.上海市浦東新區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，上海 200135; 2.復(fù)旦大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，上海 200438)

微生物廣泛存在于自然界中，大多數(shù)的空氣微生物能以菌團(tuán)形式粘附在不同粒徑的顆粒物上，形成微生物氣溶膠[1-4].空氣微生物與人類的生產(chǎn)生活和健康息息相關(guān)，是評(píng)估環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo).暴露于高濃度微生物環(huán)境中，可能會(huì)傳播病原或引發(fā)過(guò)敏性疾病，還會(huì)造成食物變質(zhì)、工業(yè)建筑設(shè)備腐蝕等危害[5-11].致病性細(xì)菌通常以氣溶膠狀態(tài)存在，人體吸入后易感染氣傳性疾病，造成呼吸道感染、胃炎、肺炎、皮膚炎癥、敗血癥、咽喉炎等疾病[12-14].空氣中微生物濃度越大，造成的健康風(fēng)險(xiǎn)越大.傳統(tǒng)地單純依靠少數(shù)理化指標(biāo)(如TSP、PM10、SO2、NOx)來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境空氣質(zhì)量的優(yōu)劣已經(jīng)不能足夠滿足現(xiàn)代保護(hù)環(huán)境和人體健康的要求，因此，及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)空氣中的細(xì)菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)保障環(huán)境安全、預(yù)防氣傳性疾病、保證人體健康具有重要意義[15-18].目前，國(guó)內(nèi)對(duì)環(huán)境中PM2.5的研究廣泛，但是關(guān)于空氣中細(xì)菌水平的研究報(bào)道較少[1,5-6,19].

鑒于監(jiān)測(cè)空氣中細(xì)菌的重大意義，全國(guó)各大城市的相關(guān)環(huán)境監(jiān)測(cè)部門應(yīng)該把空氣細(xì)菌監(jiān)測(cè)作為重點(diǎn)內(nèi)容，及時(shí)準(zhǔn)確地報(bào)告空氣微生物含量等數(shù)據(jù)，并嚴(yán)格控制空氣微生物含量水平.為了進(jìn)一步了解空氣中細(xì)菌總數(shù)分布及致病性，建立環(huán)境監(jiān)測(cè)、空氣微生物含量等數(shù)據(jù)資料，本文對(duì)上海市某區(qū)不同功能區(qū)的細(xì)菌總數(shù)及相關(guān)病原菌進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)不同時(shí)間和不同區(qū)域的差異成因進(jìn)行了初步分析，為城市環(huán)境公共衛(wèi)生狀況及疾病預(yù)防提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

電子天平(BSAl24S,費(fèi)多利斯科學(xué)儀器北京有限公司,北京)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9123A,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,上海)、超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1D,蘇州)、高壓蒸汽滅菌鍋(BOXUN, China)、恒溫?cái)U(kuò)增儀(上?？圃措娮涌萍加邢薰咎峁?、瓊脂培養(yǎng)基(Dextrose Agar, Oxoid, UK)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒(New England Biolab)、SYBR Green顯色劑(索萊寶有限公司)、所有其他試劑均購(gòu)自Sigma，全部引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成.

1.2 監(jiān)測(cè)位點(diǎn)的選擇

為了確保監(jiān)測(cè)點(diǎn)位采集的樣品具有代表性，在某區(qū)區(qū)域內(nèi)共設(shè)置4個(gè)點(diǎn)位.各個(gè)點(diǎn)位采樣高度距地面1.2m.其中點(diǎn)位1代表學(xué)校和化工地區(qū)混合區(qū)，點(diǎn)位2代表居民、商業(yè)和學(xué)?；旌蠀^(qū)，點(diǎn)位3代表生物制藥和IT行業(yè)混合區(qū)，點(diǎn)位4代表農(nóng)村地區(qū).

1.3 監(jiān)測(cè)方法

環(huán)境空氣中全部細(xì)菌的采集： FA-1型六級(jí)撞擊式空氣微生物采樣器，采樣流量為28.3L/min，采樣時(shí)間為5min，采集體積為141.5L.采樣時(shí)間段為2017年7—12月份，每月的中旬連續(xù)5天采集細(xì)菌樣品.細(xì)菌采樣采用裝有普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平皿[20].采樣后細(xì)菌在(37±1) ℃連續(xù)培養(yǎng)48h，用菌落計(jì)數(shù)器和放大鏡立即進(jìn)行平皿菌落的計(jì)數(shù).細(xì)菌總數(shù)分析方法的技術(shù)依據(jù)是： GB/T 18204.3—2013《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第3部分： 空氣微生物》——細(xì)菌部分.

環(huán)境空氣中部分致病細(xì)菌的采集： 青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所制造的嶗應(yīng)2050型空氣智能中流量采樣器，采樣流量為100L/min，采樣時(shí)間為8h.采樣濾膜采用石英濾膜，事先經(jīng)400℃高溫烘烤1h.采樣完成后，取1/4張濾膜，轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，加入12mL無(wú)菌生理鹽水，充分反復(fù)洗脫，使過(guò)濾物溶于無(wú)菌水.將含有過(guò)濾物的無(wú)菌水置于新的離心管內(nèi)，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，離心時(shí)間3min，離心完成后去除上清液.將裝有沉淀物的滅菌離心管置于架子上，向沉淀中加入100μL裂解液，渦旋混勻，在100℃的條件下加熱5min.將離心管置于離心機(jī)中，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，離心時(shí)間3min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，取5μL加入20μL的LAMP檢測(cè)試劑中，63℃反應(yīng)45min，讀取檢測(cè)結(jié)果.

空氣中致病細(xì)菌的檢測(cè)采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)進(jìn)行，金黃色葡萄球菌擴(kuò)增的目的基因?yàn)槟蜔岷怂崦富騈uc，沙門氏菌(鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌)擴(kuò)增的目的基因?yàn)槟c毒素基因Stn，通過(guò)Primer Explorer V5在線軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過(guò)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品篩選及其他細(xì)菌品種進(jìn)行特異性鑒定，選擇準(zhǔn)確性與特異性最好的引物進(jìn)行樣品分析，反應(yīng)溫度： 63℃，反應(yīng)時(shí)間： 45min.當(dāng)擴(kuò)增信號(hào)拐點(diǎn)時(shí)間小于30min時(shí)，判斷為樣本中某菌檢出.

1.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值為中國(guó)科學(xué)院生態(tài)研究中心發(fā)布的《大氣微生物評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》[5,7]，這類評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值也是江蘇省目前應(yīng)用的指標(biāo).

2 結(jié)果與分析

2.1 某大型城市某區(qū)空氣中細(xì)菌的空間變化特征

2017年7—12月，4個(gè)點(diǎn)位的微生物監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1，細(xì)菌與微生物總數(shù)分布情況見(jiàn)圖1(第242頁(yè)).

表1 點(diǎn)位1～4的細(xì)菌監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)結(jié)果

圖1 該區(qū)2017年7月—12月細(xì)菌與微生物總數(shù)分布情況Fig.1 The distribution of total bacteria and microorganisms in this district from July to December 2017

利用平皿菌落計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)菌總數(shù)分布現(xiàn)狀，由表1可以看出，點(diǎn)位1細(xì)菌總數(shù)只有8月為較清潔，其余月份均為清潔；點(diǎn)位2、點(diǎn)位3、點(diǎn)位4全年都為清潔.2017年全年該區(qū)4個(gè)監(jiān)測(cè)站點(diǎn)微生物總量的變化范圍是294～1862CFU/m3，低于3000CFU/m3，依據(jù)《大氣微生物評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》評(píng)價(jià)，該區(qū)的空氣始終處于清潔水平，空氣質(zhì)量較好.

由圖1可知，該區(qū)各監(jiān)測(cè)站點(diǎn)的細(xì)菌濃度與微生物總數(shù)無(wú)明顯線性相關(guān)關(guān)系.從空間位置看，微生物污染情況與4個(gè)點(diǎn)位的地理位置關(guān)系不是非常明顯.相對(duì)來(lái)說(shuō)，點(diǎn)位1(學(xué)校和化工地區(qū)混合區(qū))的細(xì)菌和微生物水平略高，點(diǎn)位3(生物制藥和IT行業(yè)混合區(qū))的細(xì)菌和微生物水平略低.

2.2 該區(qū)空氣中致病菌的檢測(cè)結(jié)果

沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是生活中常見(jiàn)的致病細(xì)菌，能夠引起呼吸道疾病和腸道疾病，本文以這兩種致病菌為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè).通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)株的篩選與重復(fù)驗(yàn)證，最終檢測(cè)引物序列見(jiàn)表2.

表2 用于LAMP的檢測(cè)引物

檢測(cè)結(jié)果如表3所示.其中“-”表示無(wú)樣本，“×”表示未檢出，“√”表示檢出.

表3 沙門氏菌和金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)表3可知，夏季(7—9月)空氣中檢出沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的概率更高.進(jìn)入秋季(10—12月)，空氣中檢出沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的概率逐漸降低.整體看來(lái)，4個(gè)采樣點(diǎn)秋季檢測(cè)的致病細(xì)菌概率少于夏季檢測(cè)到的致病細(xì)菌概率，這可能與夏季溫度更適合細(xì)菌繁殖有關(guān)[9,15].

LAMP陽(yáng)性樣本的驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，2～6和8～11陽(yáng)性樣本對(duì)應(yīng)的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌電泳條帶呈階梯狀，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而陰性對(duì)照無(wú)階梯狀條帶，與表3結(jié)果相一致。

圖2 LAMP檢測(cè)結(jié)果電泳圖Fig.2 The electrophoresis results of LAMPM: DNA Marker;1～6為沙門氏菌檢測(cè)。1： 陰性對(duì)照；2： 7月點(diǎn)位4；3： 8月點(diǎn)位3；4： 9月點(diǎn)位2；5： 9月點(diǎn)位4；6： 10月點(diǎn)位4；7～11為金黃色葡萄球菌檢測(cè)。7： 陰性對(duì)照；8： 8月點(diǎn)位1；9： 8月點(diǎn)位2；10： 8月點(diǎn)位3；11： 9月點(diǎn)位4.

此外，從表3中可見(jiàn)金黃色葡萄球菌與沙門氏菌存在的時(shí)間與細(xì)菌總數(shù)的峰值關(guān)系不明顯.因此，盡管根據(jù)中科院生態(tài)研究中心發(fā)布的大氣微生物評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該區(qū)的空氣質(zhì)量狀況為清潔，我們?nèi)砸P(guān)注特殊的致病細(xì)菌，避免疾病風(fēng)險(xiǎn).

3 討論與結(jié)論

本文選取了華東某大型城市某區(qū)的4個(gè)監(jiān)測(cè)站點(diǎn)： 點(diǎn)位1(學(xué)校和化工地區(qū)混合區(qū))、點(diǎn)位2(居民、商業(yè)和學(xué)?；旌蠀^(qū))、點(diǎn)位3(生物制藥和IT行業(yè)混合區(qū))、點(diǎn)位4(農(nóng)村地區(qū)).在2017年7—12月期間，采用FA-1型六級(jí)撞擊式空氣微生物采樣器對(duì)細(xì)菌總數(shù)和微生物總數(shù)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，采用嶗山2050型空氣智能中流量采樣器對(duì)4個(gè)功能區(qū)的特定致病菌進(jìn)行了收集并應(yīng)用LAMP檢測(cè)方法對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌兩種致病菌進(jìn)行了檢測(cè)分析.研究結(jié)果表明，該區(qū)在2017年下半年細(xì)菌總數(shù)和微生物總數(shù)基本上都處于清潔級(jí)別.盡管細(xì)菌總數(shù)和微生物總數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，該區(qū)仍存在致病菌.致病菌檢測(cè)結(jié)果顯示： 夏季空氣中的致病細(xì)菌種類較多，進(jìn)入秋季，空氣中致病細(xì)菌種類明顯減少.在夏季樣本中(7—9月)，40%的樣本中檢測(cè)出沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，進(jìn)入十月份后，這兩種致病細(xì)菌的出現(xiàn)概率大大降低.因此，在日常生活中，有關(guān)部門除了關(guān)注細(xì)菌總數(shù)和微生物總數(shù)的變化情況外，也要關(guān)注某些致病菌的存在來(lái)避免相關(guān)疾病的發(fā)生.對(duì)某些特定區(qū)域，要建立完善的預(yù)警系統(tǒng)，防止傳染性、致病性空氣微生物的傳播，為公眾創(chuàng)造健康、良好的生存環(huán)境.此外，目前我國(guó)尚未頒布空氣微生物監(jiān)測(cè)分析方法，該領(lǐng)域的技術(shù)方法需進(jìn)一步完善.