何 懿，吳家雪

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

肝癌是一種十分常見(jiàn)的癌癥.其進(jìn)展快，惡性程度高，極易從肝臟轉(zhuǎn)移到全身.在世界范圍內(nèi)，肝癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)占癌癥死亡人數(shù)的第三位，而且肝癌也是肝硬化患者主要的死亡原因[1].肝癌中最常見(jiàn)的組織亞型是肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC).HCC由肝細(xì)胞發(fā)展形成，占到肝癌總數(shù)的70%～85%[2].在腫瘤導(dǎo)致的死亡中，接近90%是由腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的[3].因?yàn)楦闻K中存在充沛的血管，血管入侵在HCC患者中十分常見(jiàn).同時(shí)，作為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要步驟，血管入侵也是HCC開(kāi)始轉(zhuǎn)移的標(biāo)志之一.

microRNA是一類長(zhǎng)度為21～24nt的非編碼RNA[4].microRNA能夠通過(guò)種子序列結(jié)合在mRNA的3′UTR，誘導(dǎo)mRNA降解或是阻礙翻譯，而究竟是誘導(dǎo)降解還是阻礙翻譯則取決于種子序列是否完全匹配.許多研究表明，microRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，包括誘導(dǎo)增殖[5]，調(diào)控組織入侵和轉(zhuǎn)移[6]，誘導(dǎo)血管生成[7]和阻止凋亡[8].

在過(guò)去的幾十年間，芯片技術(shù)和測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)愈發(fā)地成熟，其成本也在穩(wěn)步下降.與此同時(shí)，結(jié)合高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)與低通量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證逐漸成為研究的主流，在腫瘤研究領(lǐng)域尤為這樣.高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)能夠使用數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)十萬(wàn)的探針同時(shí)檢測(cè)所有的DNA、RNA或蛋白質(zhì).這是傳統(tǒng)的低通量的實(shí)驗(yàn)手段不可比擬的.雖然高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)能夠產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)，但研究人員在一個(gè)課題中往往只會(huì)用到其中的一小部分，其余部分則不被關(guān)注.這些儲(chǔ)存在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)是巨大的寶庫(kù).通過(guò)分析挖掘這些數(shù)據(jù)，能夠增加自己研究的可信度或是找到新的研究靶點(diǎn).

本研究使用生物信息學(xué)挖掘結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，找到了新的促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的microRNA hsa-miR-371a-3p，及其可能調(diào)控的靶基因MRVI1和UBR7.

1 材料與方法

1.1 檢索式與納入-排除標(biāo)準(zhǔn)

使用檢索式在Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)、Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)和ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索.檢索式與檢索結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 檢索式與檢索結(jié)果

肝癌樣本根據(jù)是否存在血管入侵分為轉(zhuǎn)移性肝癌樣本和非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本.納入標(biāo)準(zhǔn)： (1) 研究必須是原創(chuàng)性研究；(2) 數(shù)據(jù)集必須包含至少10個(gè)轉(zhuǎn)移性肝癌樣本和非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本；(3) 數(shù)據(jù)集必須包含高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，即芯片數(shù)據(jù)或測(cè)序數(shù)據(jù).排除標(biāo)準(zhǔn)： (1) 同一個(gè)機(jī)構(gòu)的重復(fù)報(bào)告；(2) 不同時(shí)包含轉(zhuǎn)移性肝癌樣本和非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本.

1.2 生物信息學(xué)分析涉及的數(shù)據(jù)集和數(shù)據(jù)庫(kù)

納入分析的GEO數(shù)據(jù)集： GSE76903[9]、GSE67140[10]、GSE6857[11]、GSE10694[12]和GSE20594[13].TCGA數(shù)據(jù)： TCGA-LIHC項(xiàng)目中的miRNA-seq數(shù)據(jù)、RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù).靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)： TargetScanHuman[14]、miRTarBase[15]、miRWalk 3.0[16]和miRDB[17].

1.3 細(xì)胞系和主要試劑

人肝癌細(xì)胞系QGY-7703和SMMC-7721購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù).TRIzol購(gòu)自Thermo.DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco.雙抗(鏈霉素-青霉素)購(gòu)自上海翊圣生物科技公司.轉(zhuǎn)染試劑PEI購(gòu)自Polyscience.microRNA hsa-miR-371a-3p的反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物對(duì)以及類似物mimics由吉瑪公司合成.反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自Toyobo.

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在六孔板中使用PEI對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染negative control(NC)或hsa-miR-371a-3p mimics.轉(zhuǎn)染前一天晚上鋪板，第二天細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%的時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)染.準(zhǔn)備兩個(gè)1.5mL離心管，標(biāo)記為A、B，分別加入125μL無(wú)血清培養(yǎng)基.在A中加入2μg NC或mimics，在B中加入6μL PEI，孵育5min.將A中的液體加入B中，充分混合混勻，孵育20min.將混合液加入六孔板中，6～8h后換液.

表2 引物列表

1.5 總RNA抽提、RT-PCR和qPCR

使用TRIzol裂解細(xì)胞，然后使用苯酚/氯仿混合液抽提，最后使用乙醇進(jìn)行沉淀純化，得到細(xì)胞總RNA.檢測(cè)microRNA表達(dá)的時(shí)候，使用莖環(huán)引物和Random引物進(jìn)行RT-PCR.檢測(cè)mRNA表達(dá)的時(shí)候，使用Random引物進(jìn)行RT-PCR.使用SYBR-Green法進(jìn)行qPCR，引物見(jiàn)表2.microRNA表達(dá)水平的檢測(cè)使用RNU6作為內(nèi)參，mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)使用β-actin作為內(nèi)參.

1.6 細(xì)胞愈傷實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞在六孔板中過(guò)夜培養(yǎng).轉(zhuǎn)染24h且細(xì)胞匯合度達(dá)到100%后，進(jìn)行細(xì)胞愈傷實(shí)驗(yàn).使用20μL槍頭在六孔板中劃出多條直徑相同的直線，然后將PBS沿壁加入，重復(fù)清洗3次.將完全培養(yǎng)基換成DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基.使用奧林巴斯倒置顯微鏡IX73型對(duì)劃痕進(jìn)行拍照，記錄劃痕產(chǎn)生0h以及24h后的傷口愈合情況.根據(jù)劃痕的面積變化計(jì)算出傷口愈合速率，從而反映細(xì)胞遷移能力.

1.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

使用Corning公司的24孔板進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn).細(xì)胞轉(zhuǎn)染6h后，消化細(xì)胞，使用DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基重懸.將固定數(shù)量的細(xì)胞(QGY-7703： 2×105cells或SMMC-7721： 5×105cells)加入轉(zhuǎn)移小室上部.在轉(zhuǎn)移小室下部加入完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行遷移.細(xì)胞培養(yǎng)24h后，使用3%多聚甲醛固定30min，隨后使用0.1%結(jié)晶紫染色2h.染色結(jié)束后使用PBS清洗轉(zhuǎn)移小室下部3次.使用棉棒蘸取75%乙醇，輕輕擦去轉(zhuǎn)移小室上部殘留的細(xì)胞.使用奧林巴斯倒置顯微鏡IX73型對(duì)轉(zhuǎn)移小室下部進(jìn)行拍照.隨機(jī)選取6個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)視野中細(xì)胞的數(shù)量.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用ImageJ軟件檢測(cè)細(xì)胞愈傷實(shí)驗(yàn)的劃痕面積以及統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)量.使用R和Graphpad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.不同組別之間使用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD).使用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析hsa-miR-371a-3p的表達(dá)水平和靶基因的mRNA表達(dá)之間的關(guān)系.microRNA和mRNA的qPCR檢測(cè)數(shù)值使用公式2-ΔΔCt進(jìn)行轉(zhuǎn)化.柱形圖分析結(jié)果表示mean±SD，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2 結(jié) 果

2.1 肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)microRNA的挖掘

數(shù)據(jù)集的檢索和篩選流程見(jiàn)圖1(a).根據(jù)材料與方法中的檢索式在Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索包含肝癌轉(zhuǎn)移樣本的microRNA表達(dá)譜的數(shù)據(jù)集.檢索到的結(jié)果隨后根據(jù)納入-排除標(biāo)準(zhǔn)以及人工閱讀的方法進(jìn)一步篩選，最終得到5個(gè)數(shù)據(jù)集，分別是GSE76903、GSE67140、GSE6857、GSE10694和GSE20594，一共包含230個(gè)轉(zhuǎn)移性肝癌樣本和374個(gè)非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本.轉(zhuǎn)移性肝癌樣本和非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本根據(jù)是否存在血管入侵進(jìn)行分類.

數(shù)據(jù)集分析整合以及分析結(jié)果驗(yàn)證的流程見(jiàn)圖1(b).每個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和分析，提取出上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)的microRNA列表，然后分別根據(jù)|logFC|從大到小進(jìn)行排序.為了整合5個(gè)數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果，我們引入了RobustRankAggregation(RRA)算法[18].該算法假設(shè)存在一個(gè)由所有差異表達(dá)的microRNA組成的池，然后計(jì)算每個(gè)microRNA在5個(gè)排序列表中隨機(jī)分布的P值.P值越小的microRNA就越不可能是隨機(jī)分布的，越有可能是真正差異表達(dá)的.同時(shí)，為了增加結(jié)果的穩(wěn)健性，我們引入了交叉留一法(LOOCV)進(jìn)行修正.具體方法是： 隨機(jī)舍棄5個(gè)數(shù)據(jù)集中的一個(gè)，對(duì)剩下的4個(gè)數(shù)據(jù)集使用RRA算法，記錄每個(gè)microRNA的P值.重復(fù)運(yùn)行10000次.對(duì)每個(gè)microRNA的10000個(gè)P值取中位數(shù)，作為這個(gè)microRNA的修正P值.針對(duì)上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)的microRNA列表分別進(jìn)行分析.microRNA按照修正P值從小到大進(jìn)行排序，保留排名前20的microRNA進(jìn)行后續(xù)分析.排名前20的microRNA與其修正P值見(jiàn)表3.

表3 排名前20的microRNA與其修正P值

2.2 TCGA數(shù)據(jù)驗(yàn)證

使用R從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肝癌樣本和正常肝組織樣本的miRNA-seq數(shù)據(jù)、RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù).與數(shù)據(jù)集中的分類方法一樣，肝癌樣本按照是否存在血管入侵分為轉(zhuǎn)移性肝癌樣本和非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本.比較上一步分析得到的20個(gè)上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)的microRNA共40個(gè)在兩組之間的表達(dá)水平的差異，條件設(shè)為P<0.1，結(jié)果以箱線圖的形式呈現(xiàn).20個(gè)上調(diào)差異表達(dá)的microRNA中，其中2個(gè)的表達(dá)趨勢(shì)在數(shù)據(jù)集中和TCGA數(shù)據(jù)中是一致的，分別是hsa-miR-371a-3p和hsa-miR-301a-3p(圖2(a)).20個(gè)下調(diào)差異表達(dá)的microRNA中，其中7個(gè)的表達(dá)趨勢(shì)在數(shù)據(jù)集中和TCGA數(shù)據(jù)中是一致的，分別是hsa-miR-100-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-195-5p和hsa-miR-30c-2-3p(圖2(b)).總共有9個(gè)microRNA在TCGA數(shù)據(jù)中得到驗(yàn)證.我們對(duì)比了9個(gè)microRNA在肝癌組織和正常肝組織樣本之間表達(dá)水平的差異.結(jié)果顯示(圖2(c))，9個(gè)microRNA的表達(dá)趨勢(shì)和轉(zhuǎn)移性與非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本之間的表達(dá)趨勢(shì)一致，且差異均達(dá)到顯著水平.這說(shuō)明9個(gè)microRNA不僅可能與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，還可能與肝癌發(fā)生發(fā)展的其他步驟相關(guān).在9個(gè)microRNA中，8個(gè)已被證明能夠調(diào)控肝癌的轉(zhuǎn)移.有研究表明，hsa-miR-301a-3p[19]能夠促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移，hsa-miR-100-5p[20]，、hsa-miR-126-3p[21]、hsa-miR-139-5p[22]、hsa-miR-101-3p[23]、hsa-miR-192-5p[24]、hsa-miR-195-5p[25]和hsa-miR-30c-2-3p[26]能夠抑制肝癌轉(zhuǎn)移，只有hsa-miR-371a-3p還未有肝癌相關(guān)的研究.這8個(gè)microRNA對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移促進(jìn)或是抑制的調(diào)控方向與之前的分析結(jié)果相吻合，從側(cè)面印證了之前分析的正確性.因此，我們選擇hsa-miR-371a-3p作為新的潛在的調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移的microRNA進(jìn)行后續(xù)的研究.

2.3 hsa-miR-371a-3p能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移

因?yàn)閔sa-miR-371a-3p在轉(zhuǎn)移性肝癌樣本中上調(diào)表達(dá)，所以我們猜測(cè)它可能對(duì)肝癌的轉(zhuǎn)移存在正向調(diào)控的作用.肝癌細(xì)胞的遷移能力能夠部分地反映肝癌的轉(zhuǎn)移能力，因此我們探究了hsa-miR-371a-3p對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響.我們選擇QGY-7703和SMMC-7721人肝癌細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞愈傷實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，對(duì)比hsa-miR-371a-3p過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組的傷口愈合速率以及遷移細(xì)胞的數(shù)量.細(xì)胞愈傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，hsa-miR-371a-3p過(guò)表達(dá)組的傷口愈合速率高于對(duì)照組，差異達(dá)到顯著水平(圖3(a)、(b)).細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，hsa-miR-371a-3p過(guò)表達(dá)組的遷移細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，差異達(dá)到顯著水平(圖3(c)).細(xì)胞愈傷實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同證明了hsa-miR-371a-3p能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移能力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移.

2.4 靶基因預(yù)測(cè)和KEGG通路富集分析

microRNA的靶基因預(yù)測(cè)往往伴隨著較高的假陽(yáng)性率.為了降低假陽(yáng)性率，我們使用了較為嚴(yán)格的預(yù)測(cè)方法.我們使用4個(gè)靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的4種算法分別預(yù)測(cè)hsa-miR-371a-3p的靶基因，然后對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果取交集.至少被3種算法預(yù)測(cè)到的靶基因才被納入后續(xù)的分析.通過(guò)這種方法，我們預(yù)測(cè)得到了hsa-miR-371a-3p的61個(gè)靶基因(圖4).我們對(duì)61個(gè)靶基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析.結(jié)果顯示(圖4)，靶基因富集的通路包括Transcriptional misregulation in cancer和Rap1 signaling pathway兩個(gè)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的通路，暗示了hsa-miR-371a-3p可能具有調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的能力，與前面的數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合.

2.5 靶基因的驗(yàn)證

已有許多研究表明，microRNA能夠通過(guò)降解mRNA或是阻礙翻譯的方式降低靶基因蛋白質(zhì)的表達(dá).如果microRNA通過(guò)前者發(fā)揮作用，那么我們就能夠觀察到microRNA的表達(dá)和mRNA的表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系.我們從TCGA數(shù)據(jù)中的miRNA-seq數(shù)據(jù)和RNA-seq數(shù)據(jù)中提取hsa-miR-371a-3p和61個(gè)靶基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，篩選出了一批與hsa-miR-371a-3p的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的靶基因.同時(shí)，我們對(duì)靶基因在轉(zhuǎn)移性肝癌樣本和非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本中表達(dá)水平的差異進(jìn)行了t檢驗(yàn)分析，篩選出了一批在轉(zhuǎn)移性肝癌樣本中低表達(dá)，在非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本中高表達(dá)的靶基因.對(duì)兩者取交集，我們得到了7個(gè)滿足兩種分析篩選條件的靶基因，分別是SPN、FLT1、AFF1、MRVI1、UBR7、CACNA1D和PLCB4(表4).

表4 Pearson相關(guān)分析和t檢驗(yàn)結(jié)果

已有研究證明，SPN[27]、FLT1[28]和PLCB4[29]是原癌基因，AFF1[30]、MRVI1[31]和UBR7[32]是抑癌基因.尚未有針對(duì)CACNA1D的研究.之前的生物信息學(xué)分析以及實(shí)驗(yàn)均證明了hsa-miR-371a-3p具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的能力，而microRNA能夠通過(guò)降解靶基因的mRNA發(fā)揮作用.因此我們選擇抑癌基因AFF1、MRVI1和UBR7進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.AFF1、MRVI1和UBR7的Pearson相關(guān)分析結(jié)果及其mRNA表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移性與非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本之間的差異見(jiàn)(圖5).我們?cè)赒GY-7703和SMMC-7721肝癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)了hsa-miR-371a-3p，然后檢測(cè)了mRNAAFF1、MRVI1和UBR7的表達(dá).結(jié)果表明(圖5)，過(guò)表達(dá)組相比起對(duì)照組，MRVI1和UBR7的表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.而AFF1的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異.這說(shuō)明MRVI1和UBR7很可能是hsa-miR-371a-3p調(diào)控的靶基因.

3 討 論

HCC作為最常見(jiàn)的肝癌組織亞型，其惡性程度高，腫瘤異質(zhì)性大，預(yù)后差，能夠通過(guò)肝臟中充沛的血管進(jìn)行轉(zhuǎn)移.時(shí)至今日，針對(duì)轉(zhuǎn)移性HCC的有效治療手段仍然非常欠缺.因此，尋找針對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌的治療靶點(diǎn)以及開(kāi)發(fā)相應(yīng)的藥物是當(dāng)務(wù)之急.已有研究表明[33]，microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展的每個(gè)過(guò)程中均起著重要的調(diào)控作用，而且其表達(dá)量往往在肝癌的不同階段會(huì)發(fā)生顯著的變化.因此，microRNA有望成為肝癌的治療靶點(diǎn)以及診斷的指示物.

高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，其中就包括腫瘤研究領(lǐng)域.TCGA項(xiàng)目構(gòu)建了一個(gè)龐大且規(guī)范的腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)，包含33個(gè)腫瘤類型的高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及病人的臨床病理數(shù)據(jù).而GEO和ArrayExpress等數(shù)據(jù)庫(kù)則收集了各個(gè)研究機(jī)構(gòu)在研究過(guò)程中產(chǎn)生的高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).雖然高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)成本在下降，但高昂的花費(fèi)依舊限制了檢測(cè)的腫瘤樣本的數(shù)量.而且部分腫瘤由于特殊的原因難以獲取樣本，導(dǎo)致樣本量稀少.為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究者們開(kāi)發(fā)了數(shù)種meta分析的方法[34-37]，用于整合來(lái)自不同數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)，增大樣本量，從而增加預(yù)測(cè)效力或是挖掘新的靶點(diǎn).

因?yàn)楦伟┌l(fā)生轉(zhuǎn)移的患者一般不進(jìn)行手術(shù)治療，所以轉(zhuǎn)移性肝癌的樣本是非常稀缺的.為了增大樣本量，我們整合了來(lái)自5個(gè)數(shù)據(jù)集的轉(zhuǎn)移性與非轉(zhuǎn)移性肝癌樣本.由于實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的不同以及樣本異質(zhì)性，我們沒(méi)有采用常規(guī)的P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，而是選擇前20個(gè)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的microRNA進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證.我們使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證之前的分析結(jié)果，最終得到了9個(gè)表達(dá)趨勢(shì)與之前相同的microRNA，其中只有hsa-miR-371a-3p還未見(jiàn)有肝癌方面的研究.因此，我們選擇其作為研究對(duì)象.已有研究表明[38]，血清中hsa-miR-371a-3p的表達(dá)量可以作為睪丸癌的診斷指標(biāo).還有研究指出[39]，hsa-miR-371a-3p的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移.我們的生物信息學(xué)分析的結(jié)果指出hsa-miR-371a-3p可能可以正向調(diào)控肝癌的轉(zhuǎn)移，與已有的研究結(jié)果相吻合.

肝癌細(xì)胞的遷移能力能夠部分地反映肝癌的轉(zhuǎn)移能力.我們通過(guò)細(xì)胞愈傷實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證明了hsa-miR-371a-3p的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移能力，其對(duì)肝癌的轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用.hsa-miR-371a-3p的靶基因的KEGG通路富集分析的結(jié)果也與之相符.通過(guò)Pearson相關(guān)分析和t檢驗(yàn)，我們選擇抑癌基因AFF1、MRVI1和UBR7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.已有研究證明，蛋白AFF1[40]與CDK9以及CycT1結(jié)合，增加CycT1對(duì)Tat的親和力，并促使AFF1、CDK9、CycT1、Tat、ELL2和ENL/AF9形成超級(jí)延長(zhǎng)復(fù)合體(SECs)，促進(jìn)HIV的轉(zhuǎn)錄.MLL-AFF1融合常見(jiàn)于白血病患者中，研究證明[30]AFF1通過(guò)下調(diào)S100A6，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制成淋巴細(xì)胞性白血病的進(jìn)展.MRVI1參與調(diào)控鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[41]，并且能夠抑制子宮內(nèi)膜瘤的增殖、遷移和侵襲[31]；UBR7具有E3泛素連接酶活性，通過(guò)抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[32].三者均沒(méi)有肝癌方面的研究.MRVI1和UBR71在其他腫瘤中的研究均證明其具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力，因此兩者也可能具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移甚至促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的能力.hsa-miR-371a-3p過(guò)表達(dá)組中的mRNA MRVI1和UBR7的表達(dá)水平顯著下降，而AFF1的表達(dá)水平不受影響，說(shuō)明了mRNA MRVI1和UBR7可能受hsa-miR-371a-3p調(diào)控而發(fā)生降解.要證明MRVI1和UBR7是hsa-miR-371a-3p的靶基因，還需要進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn).要證明hsa-miR-371a-3p通過(guò)介導(dǎo)mRNA MRVI1和UBR7降解的方式促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移，還需要更多的分子實(shí)驗(yàn)以及活體實(shí)驗(yàn).