杜夏瑜 熊艷梅 夏靜靜 閔順耕

摘?要?利用紅外光譜結(jié)合衰減全反射技術(shù)（Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FT-IR）對啶蟲脒固體制劑中氟蟲腈的含量進(jìn)行快速測定。采用傅里葉變換紅外光譜儀采集69個固體樣品及其萃取液的光譜，探究不同預(yù)處理方法及變量選擇方法對樣品光譜的處理效果，建立固體樣品及萃取液的定量分析模型。通過Kennard-Stone算法劃分樣本集，采用偏最小二乘法建立氟蟲腈的定量模型，使用外部檢驗對模型進(jìn)行評價。結(jié)果表明，對于固體樣品，直接測定其中氟蟲腈的定量模型的決定系數(shù)為0.9762，預(yù)測均方根誤差（Root mean square error of prediction set，RMSEP）為0.0022;經(jīng)N，N-二甲基甲酰胺（DMF）萃取，上清液樣品中氟蟲腈定量模型的預(yù)測決定系數(shù)為0.9810，RMSEP為0.0019;對于氟蟲腈含量范圍在060%～5.00%的樣品，外部檢驗樣品預(yù)測平均相對誤差（MRE）為0.08。本方法可應(yīng)用于農(nóng)藥中違禁添加氟蟲腈的現(xiàn)場快速檢測。

關(guān)鍵詞?紅外光譜;偏最小二乘法;變量選擇;氟蟲腈;啶蟲脒

1?引 言

氟蟲腈屬于GABA-氯離子通道抑制劑，與常用的多類殺蟲劑無交互抗性，殺蟲譜廣，但對蜜蜂毒性高，且在水體和土壤中降解緩慢，環(huán)境友好性差[1，2]。啶蟲脒是一種新煙堿類殺蟲劑，具有較強(qiáng)的殺蟲活性，作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，可有效防治大部分產(chǎn)生抗性的害蟲。2009年2月25日農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告，對氟蟲腈的使用進(jìn)行了限制，規(guī)定含氟蟲腈成分的農(nóng)藥制劑僅能申請衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑的田間試驗、農(nóng)藥登記和銷售使用[3]。但由于氟蟲腈在啶蟲脒制劑中混合度較好，二者使用條件相似，一些不良商家和企業(yè)將氟蟲腈非法添加到啶蟲脒制劑中以增強(qiáng)施用效果，這些含有氟蟲腈的農(nóng)藥制劑的使用對人畜、環(huán)境等帶來許多不良影響，迫切需要開發(fā)一種快速檢測氟蟲腈含量的方法。

常規(guī)的氟蟲腈檢測方法為色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4～8]，這類方法需要的時間較長，且對樣品的前處理要求較高，操作繁瑣，難以適用于現(xiàn)場快速檢測。紅外光譜技術(shù)具有測定速度快、檢測成本低、對前處理要求低、非破壞性檢測等特點，在食品、農(nóng)業(yè)、化學(xué)、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)應(yīng)用廣泛[9]，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)在數(shù)據(jù)處理方面具有很大優(yōu)勢，近幾年應(yīng)用于農(nóng)藥有效成分及違禁成分的檢測[10，11]。Li 等[12]利用紅外光譜結(jié)合區(qū)間組合優(yōu)化（Interval combination optimization，ICO）算法建立了啶蟲脒乳油中氟蟲腈含量的定量模型，最優(yōu)模型的決定系數(shù)為0.9982;但未涉及啶蟲脒固體制劑中氟蟲腈含量的定量測定，且乳油的基質(zhì)相對簡單。

目前，對氟蟲腈紅外光譜定量分析的算法一般為偏最小二乘法（Partial least squares，PLS），其建模方法對校正集要求較高，建模時間長[12]，因此，在建模前需要劃分樣本，并對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理和變量選擇，采用Kennard-Stone （KS）法劃分樣本，以保證校正集樣本按照空間距離分布均勻[13]。 預(yù)處理方法包括平滑去噪算法（Smoothing）、Savitzky-Golay導(dǎo)數(shù)法（Savitzky-Golay derivative）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換法（Standard normal variation，SNV）、多元散射校正法（Multivariate scattering correction，MSC）等[14～16]，變量選擇方法包括區(qū)間偏最小二乘法（Interval partial least-squares，iPLS）、移動窗口偏最小二乘法（Moving window partial least squares，MWPLS）、ICO等[17～19]。

本研究采用紅外光譜結(jié)合衰減全反射技術(shù)（ATR-FT-IR）對啶蟲脒固體商品制劑中違禁添加的氟蟲腈含量進(jìn)行檢測，分別采用固體直接測定和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶劑萃取液測定方法，對樣品中的氟蟲腈進(jìn)行定量檢測;采用4種光譜預(yù)處理方法、3種變量選擇方法對模型進(jìn)行優(yōu)化，采用PLS法建立最優(yōu)定量模型。所建立分析方法可應(yīng)用于農(nóng)藥違禁添加氟蟲腈的現(xiàn)場快速檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Nicolet iS5TM型FT-IR光譜儀（美國Thermo Fisher公司，配有Omni iD5-ATR金剛石附件，儀器參數(shù)為：掃描范圍4000～650 cm?1，分辨率2 cm?1，掃描次數(shù)32次）;SCDEALL VX-Ⅲ型多管渦旋振蕩器（安簡（北京）科技有限公司）;TG16MW型臺式高速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

40%啶蟲脒可濕性粉劑（青島瀚生生物科技股份有限公司;農(nóng)藥登記證號：PD20096672）;70%啶蟲脒可濕性粉劑（江西禾益化工股份有限公司;農(nóng)藥登記證號：PD20142282）;40%啶蟲脒可溶粉劑（海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司;農(nóng)藥登記證號：PD20102099）;氟蟲腈原藥（95%，w/w，中國農(nóng)科院植保所農(nóng)藥廠）;乙腈、無水乙醇、DMF（分析純，北京化工廠）;所有試劑均未經(jīng)過純化，直接使用。所有的玻璃器皿及儀器可清洗部分均分別使用去離子水和無水乙醇清洗3遍，干燥后使用。

2.2?數(shù)據(jù)處理軟件

10.3版The Umscrambler X、9.2版OMNIC、R2019a 版Matlab、2019版Excel和9.1版Origin。

2.3?光譜采集及數(shù)據(jù)處理

2.3.1?樣品制備?在3種不同來源的啶蟲脒制劑中加入不同質(zhì)量的95%（w/w）氟蟲腈原藥，研細(xì)后，置于渦旋振蕩器上振蕩5 min，配制氟蟲腈濃度在0.1%～5.0%（w/w）之間的固體樣品，共69個，樣品質(zhì)量百分?jǐn)?shù)均值為1.315%，用于建立定量模型和驗證。

分別用乙腈、甲苯、二甲苯和DMF 4種溶劑對適量氟蟲腈原藥進(jìn)行溶解，其中DMF對氟蟲腈的溶解效果最好，故選用其作為固體樣品的萃取溶劑，對上述69個樣品分別萃?。悍謩e稱量適量樣品，加入1 mL萃取液，置于渦旋振蕩器上振蕩5 min，4000 r/min離心3 min，得到69個上清液，樣品質(zhì)量百分?jǐn)?shù)均值為1.344%，用于建立定量模型和驗證。

2.3.2?光譜采集?使用FT-IR光譜儀采集69個樣品及對應(yīng)的69個上清液的紅外光譜。每個樣品采集3條光譜并求平均值，以氟蟲腈在啶蟲脒制劑中的含量作為分析指標(biāo)進(jìn)行處理。

2.3.3?數(shù)據(jù)處理?對樣品和上清液的光譜數(shù)據(jù)分別建立定量模型，其步驟概述為：基線校正預(yù)處理光譜后，采用4種預(yù)處理方法（平滑去噪、Savitzky-Golay導(dǎo)數(shù)、SNV、MSC）結(jié)合3種變量選擇方法（iPLS、MWPLS、ICO）優(yōu)化定量模型。

實驗中用到的基線校正在The Umscrambler X中進(jìn)行，其余所有光譜處理的算法代碼均在Matlab中完成。模型評價采用RMSEP為指標(biāo)。

3?結(jié)果與討論

3.1?氟蟲腈、啶蟲脒制劑及樣品的衰減全反射中紅外光譜圖

圖1為氟蟲腈、啶蟲脒制劑及樣品的紅外譜圖。氟蟲腈原藥在3360～3320 cm?1處有中強(qiáng)度的吸收峰，為NH伸縮振動;2240 cm?1處的吸收峰為CN伸縮振動;1690～1630 cm?1處的強(qiáng)吸收峰為CN的伸縮振動;1590 cm?1處中強(qiáng)度的吸收峰為NH的變形振動;1360～1320 cm?1處中強(qiáng)度的吸收峰為NCN的反對稱伸縮振動;1190～1140 cm?1處中強(qiáng)度的吸收峰為NCN的對稱伸縮振動;865～810 cm?1處的吸收峰為四取代苯環(huán)的特征吸收峰。啶蟲脒制劑在3200 cm?1處的寬峰為制劑中OH的吸收;2250～2100 cm?1處的強(qiáng)吸收峰為硅藻土基質(zhì)SiH伸縮振動;1580 cm?1處的中強(qiáng)吸收峰應(yīng)為制劑基質(zhì)中的胺類或雙鍵物質(zhì);1360～1310 cm?1處的強(qiáng)吸收峰為CN的伸縮振動。

1處的峰被啶蟲脒制劑的基質(zhì)吸收掩蓋，因此對樣品進(jìn)行萃取以排除基質(zhì)的干擾。由圖1可見，萃取液的紅外光譜背景更干凈，譜圖質(zhì)量有所改善。

3.2?固體樣品中氟蟲腈定量模型的建立及優(yōu)化

對69個固體樣品對應(yīng)的69條光譜，以啶蟲脒制劑中氟蟲腈含量為化學(xué)值，通過KS法劃分校正集、驗證集樣品分別為46和23個，采用PLS法建立氟蟲腈含量的定量模型。

進(jìn)行模型優(yōu)化，對光譜進(jìn)行基線校正處理，得到光譜圖見圖2。由圖2可見，基線校正顯著消除了基線處的部分噪聲干擾。采用4種預(yù)處理方法（平滑去噪、Savitzky-Golay導(dǎo)數(shù)、SNV、MSC）結(jié)合3種變量選擇算法（iPLS、MWPLS、ICO）優(yōu)化模型，得到最優(yōu)模型為MSC預(yù)處理結(jié)合ICO方法選擇的變量建立的模型，其參數(shù)為：R2=0.9762，RMSECV=0.0017，RMSEP=0.0022（模型參數(shù)見表1）。ICO選擇的變量見圖3，選擇了波數(shù)在（a）3920～3830 cm?1、（b）3750～3580 cm?1、（c）2238～2165 cm?1、（d）1389～1310 cm?1、（e）1140～1070 cm?1和（f）908～813 cm?1的區(qū)域，其中： （a）和（b）兩區(qū)域無明顯吸收;（c）區(qū)域在2170 cm?1處有一個明顯吸收峰，是氟蟲腈的CN結(jié)構(gòu)信息，峰高隨氟蟲腈含量變化明顯;（d）和（e）兩區(qū)域的多組峰包含了氟蟲腈NCN結(jié)構(gòu)的振動信息，且峰高隨氟蟲腈含量變化明顯;（f）區(qū)域包含氟蟲腈四取代苯環(huán)骨架的特征吸收，其峰高隨氟蟲腈含量變化明顯，以上4個區(qū)域選擇的光譜范圍見圖4。模型的預(yù)測值與化學(xué)值相關(guān)關(guān)系圖見圖5，優(yōu)化后的模型對樣品的預(yù)測效果更好。

3.3?固體樣品中氟蟲腈定量模型的驗證

將KS采樣法選擇出的23個樣品作為驗證集，預(yù)測結(jié)果見表2。由表2可知，對于含量在0.10%～5.00%的樣品，預(yù)測結(jié)果的相對誤差均低于0.58;具體而言，對含量在0.10%～0.60%的樣品預(yù)測誤差較大，預(yù)測平均相對誤差（MRE）為0.37;對含量在0.60%～5.00%的樣品預(yù)測效果較好，MRE為0.10。

3.4?萃取液中氟蟲腈最優(yōu)定量模型的建立及驗證

為進(jìn)一步優(yōu)化3.2節(jié)建立的定量模型，考慮到啶蟲脒制劑固體基質(zhì)較為復(fù)雜，且不同固體制劑的基質(zhì)各不相同，對有效成分低的樣品測定干擾較大，適用范圍有限。因此，用溶劑DMF萃取固體樣品中的氟蟲腈并采集光譜，以氟蟲腈在啶蟲脒制劑中的含量為分析指標(biāo)建立模型：對光譜進(jìn)行基線校正（見圖2），顯著消除了液體樣品在基線處的噪聲;采用4種預(yù)處理方法（平滑去噪，Savitzky-Golay導(dǎo)數(shù)，SNV，MSC）結(jié)合3種變量選擇算法（iPLS，MWPLS，ICO）優(yōu)化模型。

得到最優(yōu)模型為SNV預(yù)處理結(jié)合MWPLS方法選擇的變量建立的模型，其參數(shù)為：R2=0.9810，RMSECV=0.0016，RMSEP=0.0019（模型參數(shù)見表1）。MWPLS選擇的變量見圖3，選擇了波數(shù)在（g）. 1335～1300 cm?1范圍的區(qū)域，該區(qū)域光譜見圖4。由圖4可見，區(qū)域內(nèi)1315 cm?1處有一個吸收峰，峰高隨氟蟲腈含量變化明顯，代表了氟蟲腈N-C-N的振動。模型的預(yù)測值與化學(xué)值的相關(guān)關(guān)系圖見圖5，可見萃取液建立的模型對樣品的預(yù)測效果最優(yōu)。

將KS采樣法選擇出的23個樣品作為驗證集，預(yù)測結(jié)果見表2。對于含量在0.10%～5.00%的樣品，預(yù)測結(jié)果的相對誤差均低于0.78;具體而言，對含量在0.10%～0.60%的樣品預(yù)測誤差較大，MRE為0.49;對含量在0.60%～5.00%的樣品預(yù)測效果較好，MRE為0.08。與固體樣品模型的預(yù)測能力相比，對于低含量（0.10%～0.60%）樣品的預(yù)測能力較差，可能是由于低含量樣品含量過低，稱量及萃取過程中存在較大誤差，且紅外吸收受萃取溶液溶劑峰的影響過大;對于較高含量（0.60%～5.00%）樣品的預(yù)測能力有較大提高，預(yù)測更穩(wěn)定。

4?結(jié) 論

本研究測定了固體農(nóng)藥制劑中氟蟲腈的含量及其經(jīng)萃取后液體樣品中的氟蟲腈含量，得到的模型對氟蟲腈含量在0.60%～5.00%的啶蟲脒商品制劑含量預(yù)測效果較好，MRE為0.08，在《農(nóng)藥制劑產(chǎn)品中微量其他農(nóng)藥成分限量》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)[20]允許的含量（<5%）范圍內(nèi)，能滿足實際農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)管中氟蟲腈的分析要求，為固體農(nóng)藥混合制劑中有效成分的檢出提供了理論基礎(chǔ)，但對于低含量樣品（0.10%～0.60%）有效成分的快速準(zhǔn)確檢測仍需進(jìn)一步的探索。

References

1?Tingle C C D，Rother J A，Dewhurst C F. Rev. Environ. Contam. Tokicol.，2003，176： 1-66

2?EI Hassani A K，Dacher M，Gauthier M，Armengaud C. Pharmacol. Biochem. Behav.，2005，22（1）： 68-102

3?http：//www.moa.gov.cn/govpublic/ZZYGLS/201006/t20100606_1534288.htm

農(nóng)業(yè)部第1157號公告No. 1157 Announcement of Ministry of Agriculture

4?Hafeez A，Tawab I A，Iqbal S. J. AOAC Int.，2016，99（5）：1185-1190

5?Zhang M，Bian K，Zhou T，Song X，Liu Q，Meng C. J. Chromatogr. B，2016，1014： 31-36

6?Jimenez J J，Bernal J L，del Nozal M J，Martin M T，Mayo R. J. Chromatogr. A，2007，1146（1）： 8-16

7?NING Xiao，JIN Shao-Ming，GAO Wen-Chao，CAO Jin，DING Hong. Chinese J. Anal. Chem.，2018，46（8）： 1297-1305

寧 霄，金紹明，高文超，曹 進(jìn)，丁 宏. 分析化學(xué)，2018，46（8）： 1297-1305

8?ZHU Li-Ping，ZHU Tao，PAN Yu-Xiang，SUN Jun，DONG Jing. Chinese J. Anal. Chem.，2008，36（7）： 999-1003

朱莉萍，朱 濤，潘玉香，孫 軍，董 靜. 分析化學(xué)，2008，36（7）： 999-1003

9?Antony B，Mehta B M，Sharma S，Ratnam K，Aparnathi K D. J. Food Sci. Tech.，2018，55（9）： 3632-3639

10?WU Rui-Mei，WANG Xiao，GUO Ping，AI Shi-Rong，YAN Lin-Yuan，LIU Mu-Hua. Journal of Instrumental Analysis，2013，32（11）： 1359-1363

吳瑞梅，王 曉，郭 平，艾施榮，嚴(yán)霖元，劉木華. 分析測試學(xué)報，2013，32（11）： 1359-1363

11?WU Hou-Bin，YU Rong，LIU Ping-Ping，MU Lan，LIU Feng-Mao，ZHANG Yan-Qiu，JIANG Shu-Ren，MIN Shun-Geng. Agrochemicals，2012，51（4）： 270-272

吳厚斌，于 榮，劉蘋蘋，穆 蘭，劉豐茂，張延秋，江樹人，閔順耕. 農(nóng)藥，2012，51（4）： 270-272

12?Li Q，Huang Y，Song X，Zhang J，Min S. Pest. Manag. Sci.，2019，75（6）： 1743-1749

13?Kennard R W，Stone L A. Technometrics，2012，11（1）： 137-148

14?Peter C，Grace W. Numer. Math.，1978，31（4）： 377-403

15?Ruffin C，King R L，Younan N H. Gisci. Remote Sens.，2008，45（1）： 1-15

16?Dhanoa M S，Lister S J，Sanderson R，Barnes R J. J. Near Infrared Spectrosc.，1994，2（1）： 43-47.

17?Norgaard L，Saudland A，Wagner J，Nielsen J P，Engelsen S B. Appl. Spectrosc.，2000，54（3）： 413-419

18?Jiang J H，Berry R J，Siesler H W，Ozaki Y. Anal. Chem.，2002，74（14）： 3555-3565

19?Song X，Huang Y，Yan H，Xiong Y，Min S. Anal. Chim. Acta，2016，948： 19-29

20?T/CCPIA 022-2019，Limit of Trace Amounts of Other Pesticide Ingredients in Pesticide Formulation Products. Association Standards of the People's Republic of China

農(nóng)藥制劑產(chǎn)品中微量其他農(nóng)藥成分限量. ?中華人民共和國團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn). T/CCPIA 022-2019