史瑞新 趙艷萍 管鵬 梁維新 荀合

摘?要?建立了超聲提取-單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Single particle-inductively coupled plasma-mass spectrometry，SP-ICP-MS）同時(shí)測(cè)定牙膏中納米銀顆粒（AgNPs）的粒徑分布、數(shù)量濃度和質(zhì)量濃度的方法。以0.1% Tx-100超聲提取牙膏中的AgNPs，在SP-ICP-MS模式下測(cè)定牙膏中AgNPs的粒徑分布、數(shù)量濃度和質(zhì)量濃度，考察了方法的最佳提取時(shí)間、準(zhǔn)確性和檢出限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：最佳提取時(shí)間為10 min，采用SP-ICP-MS法測(cè)定不同粒徑的AgNPs標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值一致;方法的粒徑檢出限、數(shù)量濃度檢出限和質(zhì)量濃度檢出限分別為23 nm、3.9×108 particles/kg和26 ng/kg;在牙膏樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，納米顆?；厥章试?6.6%～93.8%之間。 本方法簡(jiǎn)單、快速，為牙膏中AgNPs的測(cè)定提供了準(zhǔn)確的方法。

關(guān)鍵詞?納米銀顆粒;單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法;牙膏

1?引 言

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，大量納米顆粒產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域的商品中，其中，納米銀顆粒（AgNPs）因其對(duì)多種微生物具有良好的殺滅和抑制作用，在日用品、化妝品以及生物醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域大量使用[1]。相關(guān)研究指出，納米材料長(zhǎng)期暴露于人體，將會(huì)穿透皮膚粘膜，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)各臟器，產(chǎn)生不利的生物效應(yīng)[2]，其作用大小與納米材料的粒徑、數(shù)量和濃度密切相關(guān)[3]，日用品是人體內(nèi)AgNPs的主要來(lái)源[4]。

目前，納米顆粒的測(cè)定和表征手段主要有掃描/透射電子顯微鏡（SEM/TEM）、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）以及納米顆粒跟蹤分析（NTA）等，但該類技術(shù)存在分析成本高、樣品制備步驟復(fù)雜、尺寸以及檢出限較差等不足[5]。采用流場(chǎng)分離[6]、流體動(dòng)力色譜[7]等分離技術(shù)，并與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用，可用于分離和表征納米顆粒，但此類聯(lián)用技術(shù)檢出限較高，需要復(fù)雜的樣品富集步驟[8]。單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Single particle-inductively coupled plasma-mass spectrometry，SP-ICP-MS）由Degueldre等[9]在2003年提出，該方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢出限低，分析時(shí)間短[10]，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)納米顆粒的數(shù)量濃度測(cè)定以及粒徑分布表征。近年來(lái)，SP-ICP-MS法已被應(yīng)用于環(huán)境樣品[11～14]、食品[15]、日化用品[16]、紡織品[17]、生物樣品[18～20]中納米顆粒的表征和測(cè)定。由于納米顆粒普遍存在于復(fù)雜基質(zhì)樣品中，必需的樣品前處理過(guò)程容易造成納米顆粒物的團(tuán)聚或分解，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。因此，復(fù)雜基質(zhì)樣品中納米顆粒的分析表征方法是目前SP-ICP-MS研究的一個(gè)主要難點(diǎn)及方向。牙膏是與人體消化道長(zhǎng)期直接接觸的物質(zhì)，抗菌牙膏中含有的AgNPs可直接進(jìn)入人體，并會(huì)在體內(nèi)蓄積，對(duì)人體產(chǎn)生內(nèi)暴露危害影響。目前，尚未見(jiàn)牙膏中的納米顆粒物分析表征方法的報(bào)道。為此，建立穩(wěn)定可靠的納米銀顆粒表征方法對(duì)于日用品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)具有應(yīng)用價(jià)值。

本研究將超聲提取與SP-ICP-MS進(jìn)行聯(lián)用，考察了超聲條件對(duì)AgNPs的提取和測(cè)定影響，建立了超聲提取-單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牙膏中AgNPs的粒徑分布、數(shù)量濃度和質(zhì)量濃度。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器、試劑與材料

Agilent ICP-MS/MS 8800三重四極桿電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）;BSA224S-CW型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）;BILON-250Y超聲波處理器（上海比朗儀器有限公司）。

HNO3（電子級(jí)，德國(guó)Merck公司）;Ag標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1000 mg/L，國(guó)家鋼鐵研究院）;40、60和80 nm AgNPs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（20 mg/L，美國(guó)Sigma公司）;含有1 μg/L的Ce、Co、Li、Tl、Y的調(diào)諧液（美國(guó)安捷倫公司）;曲拉通（聚乙二醇辛基苯基醚，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，分析純，濃度為0.1%）。 實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ· cm）。

選用3種市售抗菌牙膏作為研究對(duì)象。

2.2?SP-ICP-MS儀器操作條件

采用調(diào)諧液對(duì)ICP-MS儀器進(jìn)行調(diào)諧，使ICP-MS靈敏度達(dá)到最佳狀態(tài)。采用ICP-MS的“No Gas”調(diào)諧模式對(duì)107Ag進(jìn)行測(cè)定，相關(guān)儀器操作條件見(jiàn)表1。

2.3?標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)離子響應(yīng)溶液的配制：采用0.5% HNO3將Ag+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋至0.2、0.5、1、5和10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于測(cè)定ICP-MS對(duì)Ag+的響應(yīng)靈敏度;標(biāo)準(zhǔn)參比顆粒物溶液的配制： 以水將60 nm AgNPs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為100 ng/L 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于計(jì)算傳輸效率。

2.4?樣品處理方法

2.4.1?超聲提取-SP-ICP-MS?使用曲拉通溶液提取牙膏中的AgNPs[21～23]。 擠出20 mm膏體，棄去，準(zhǔn)確稱取0.1 g 牙膏樣品，置于50 mL離心管中，使用0.1% Tx-100溶液定容至30 mL后，振蕩搖勻，超聲10 min，以水稀釋至一定倍數(shù)后，搖勻，備用。空白樣品按照相同步驟處理，但不添加牙膏樣品。

2.4.2?元素總量測(cè)定?棄去樣品頭部20 mm 膏體后，準(zhǔn)確稱取牙膏樣品0.25 g 于50 mL燒杯中，加入6 mL王水（濃HCl-濃HNO3，1∶3，V/V），加熱至樣品溶解后，滴加5滴H2O2，加熱消化至近干后，以1% HNO3定容至50 mL，搖勻備用[24]?？瞻讟悠钒凑障嗤襟E處理，但在過(guò)程中不添加牙膏樣品。

3?結(jié)果與討論

3.1?方法原理

SP-ICP-MS是在傳統(tǒng)ICP-MS的基礎(chǔ)上，采用“單顆粒分析”工作模式的分析技術(shù)。當(dāng)單個(gè)納米顆粒被引入到質(zhì)譜儀后，受到等離子體的激發(fā)，形成一簇離子云，到達(dá)檢測(cè)器后，在短暫的駐留時(shí)間內(nèi)形成較強(qiáng)的脈沖信號(hào)，通過(guò)記錄每個(gè)駐留時(shí)間內(nèi)的強(qiáng)度值形成時(shí)間分辨數(shù)據(jù)。在時(shí)間分辨數(shù)據(jù)中，脈沖信號(hào)的數(shù)量與溶液中納米顆粒的數(shù)量成正比關(guān)系，脈沖信號(hào)的強(qiáng)度與納米顆粒的質(zhì)量以及粒徑相關(guān)，因此，通過(guò)SP-ICP-MS可以同時(shí)提供納米顆粒的粒徑分布以及質(zhì)量濃度等信息。

Peters等[26]提供了一種納米顆粒物濃度以及粒徑的分布和計(jì)算方法。通過(guò)已知顆粒濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在單位時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到的脈沖信號(hào)數(shù)量以及樣品流速計(jì)算傳輸效率，采用傳輸效率、標(biāo)準(zhǔn)離子響應(yīng)強(qiáng)度以及脈沖信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算納米顆粒的質(zhì)量及其粒徑，計(jì)算公式如下：

其中，Cp為顆粒數(shù)量濃度（particles/L）;NP為在時(shí)間范圍內(nèi)檢測(cè)到的顆粒數(shù)（particles/L）;ηn為傳輸效率;V為樣品流速（mL/min）;Ip為樣品中納米粒子的信號(hào)強(qiáng)度（cps）;mp為納米顆粒質(zhì)量（ng）;RFION為離子響應(yīng)強(qiáng)度（cps/μg/L）;td為停留時(shí)間（s）;Mp為納米粒子的摩爾質(zhì)量;Ma為納米粒子中待測(cè)元素的摩爾質(zhì)量;dp為納米粒子的粒徑（nm）;ρp為納米粒子的密度（g/mL）;Cm為納米粒子質(zhì)量濃度（ng/L）。

3.2?干擾元素考察

測(cè)定107Ag的主要干擾為多原子化合物91Zr16O、67Zn40Ar等。本研究將牙膏樣品消解后，采用ICP-MS氦氣碰撞反應(yīng)模式測(cè)定了3種牙膏樣品中各元素含量（表2）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種牙膏樣品的消解液均為澄清溶液，Zn、Zr的含量分別為2.29～3.51 μg/g 和0.22～2.66 μg/g，樣品中的Zn和Zr濃度較低，在SP-ICP-MS分析模式中，其形成的多原子化合物干擾信號(hào)將會(huì)處于背景信號(hào)區(qū)域中[8]（見(jiàn)圖1A），因此，無(wú)需氣體碰撞池即可與AgNPs脈沖信號(hào)區(qū)分;同時(shí)，由于引入反應(yīng)碰撞氣體，將會(huì)降低儀器107Ag的靈敏度，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中AgNPs的測(cè)定采用“No Gas”調(diào)諧模式。

3.3?提取條件考察

考察了超聲時(shí)間對(duì)3種牙膏中AgNPs提取效果的影響。分別向3種牙膏中加入適量的60 nm AgNPs，混合均勻，并穩(wěn)定5 h后，使用0.1% Tx-100溶液定容至30 mL，分別超聲5、10和15 min，以水稀釋一定倍數(shù)后，采用SP-ICP-MS法測(cè)定。計(jì)算稀釋液中AgNPs的數(shù)量濃度及其加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)提取時(shí)間為10 min時(shí)，3種牙膏的顆?；厥章试?5.4%～92.7%之間;3種牙膏的加標(biāo)回收率均低于100%，這是由于牙膏的基質(zhì)影響，使AgNPs在基質(zhì)中持續(xù)釋放Ag+，導(dǎo)致部分的顆粒被分解[23]。

3.4?SP-ICP-MS響應(yīng)因子以及傳輸效率的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)因子用于將每個(gè)脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的納米顆粒質(zhì)量，以cps/（μg/L）單位表示，其數(shù)值的大小即為離子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度曲線的斜率[17]，通過(guò)計(jì)算，本研究中107Ag的響應(yīng)因子為40440 cps/（μg/L）。 傳輸效率為納米顆粒進(jìn)入等離子體與霧化器中的數(shù)量比率，本研究采用已知濃度的AgNPs標(biāo)準(zhǔn)工作液測(cè)定ICP-MS的傳輸效率，測(cè)定前，使用3% HNO3和水分別沖洗ICP-MS進(jìn)樣系統(tǒng)10 min，在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，根據(jù)公式（1）計(jì)算得該儀器的傳輸效率為3.2%。

3.5?SP-ICP-MS方法準(zhǔn)確性

在進(jìn)行樣品測(cè)定前，在空白牙膏稀釋液（稀釋103倍，含有0.0001% Tx-100）中加入40、60和80 nm濃度為100 ng/L的AgNPs標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證SP-ICP-MS的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表4和圖1。由圖1可知，3種AgNPs的脈沖信號(hào)均可以較好地與背景信號(hào)分離，脈沖信號(hào)的強(qiáng)度值與納米顆粒標(biāo)準(zhǔn)品的粒徑呈正相關(guān)，脈沖整體呈正態(tài)分布。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)值與本方法對(duì)AgNPs的測(cè)定值（表4）可知，通過(guò)SP-ICP-MS獲得的AgNPs顆粒濃度和粒徑均與標(biāo)準(zhǔn)值一致。

3.6?方法檢出限

本研究采用迭代算法計(jì)算納米顆粒的粒徑檢出限（LODs）。 首先根據(jù)公式（5）計(jì)算區(qū)別于背景信號(hào)區(qū)分的最低脈沖信號(hào)強(qiáng)度In+1，然后將其代入至公式（2）和（3）中，計(jì)算得到本方法對(duì)AgNPs的粒徑檢出限為23 nm;在SP-ICP-MS模式下，測(cè)定空白對(duì)照樣品，平行實(shí)驗(yàn)7次，計(jì)算脈沖信號(hào)數(shù)量的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，由于牙膏樣品需稀釋進(jìn)樣，以1000倍稀釋倍數(shù)計(jì)算，本方法對(duì)AgNPs的數(shù)量濃度檢出限（LODNP）為3.9×108 particles/kg。質(zhì)量濃度檢出限（LODMP）通過(guò)計(jì)算數(shù)量濃度檢出限以及粒徑檢出限對(duì)應(yīng)的納米顆粒質(zhì)量得出，以23 nm AgNPs和1000倍稀釋倍數(shù)計(jì)算，本方法的質(zhì)量濃度檢出限為26 ng/kg。

其中： In+1為在與背景信號(hào)區(qū)分的最低信號(hào)強(qiáng)度（cps）;In為第n次迭代運(yùn)算中所有信號(hào)強(qiáng)度的平均值（cps）;ISD為第n次迭代運(yùn)算中所有信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差;LODs粒徑檢出限（nm）;dp為根據(jù)式（3）計(jì)算所得粒徑（nm）;LODNP為數(shù)量濃度檢出限（particles/kg）;Np為空白對(duì)照樣品中所測(cè)得的納米顆粒脈沖信號(hào)的平均數(shù)量;SDP是空白對(duì)照樣品中納米顆粒脈沖信號(hào)數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差;ηn為傳輸效率;V為樣品流速（mL/min）;ta為測(cè)定時(shí)間（min）;LODMP為質(zhì)量濃度檢出限（ng/kg）;mp為粒徑檢出限對(duì)應(yīng)的納米顆粒質(zhì)量（ng）。

3.7?牙膏樣品中納米銀SP-ICP-MS表征

采用所建立的SP-ICP-MS方法對(duì)3種牙膏進(jìn)行測(cè)定，由于顆粒濃度過(guò)高的溶液將會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)或多個(gè)納米顆粒同時(shí)進(jìn)入等離子體質(zhì)譜儀中，并受到激發(fā)，造成在同一駐留時(shí)間內(nèi)發(fā)生脈沖信號(hào)的疊加[27]，在單納米顆粒測(cè)定中，待測(cè)溶液中顆粒濃度范圍應(yīng)維持在106～109 particles/L之間[28]，本研究中牙膏樣品的顆粒濃度均被稀釋至此范圍后再進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如圖2和表5所示，牙膏3出現(xiàn)了明顯的AgNPs脈沖信號(hào)，

經(jīng)計(jì)算得到此樣品中AgNPs的平均粒徑為39 nm，質(zhì)量濃度為22.86 μg/g，與表2計(jì)算的總銀含量（31.45 μg/g）接近，牙膏1以及牙膏2中均未檢出AgNPs。加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加標(biāo)后牙膏3的原始信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，粒徑分布圖中出現(xiàn)了60 nm AgNPs的峰，3組加標(biāo)樣品計(jì)算的平均粒徑均與標(biāo)準(zhǔn)值一致，納米顆粒回收率在86.6%～93.8%之間。

4?結(jié) 論

建立了超聲提取-SP-ICP-MS法同時(shí)測(cè)定牙膏中AgNPs粒徑分布、數(shù)量濃度以及質(zhì)量濃度的方法。首先確定方法的離子響應(yīng)強(qiáng)度以及傳輸效率，采用0.1% Tx-100提取牙膏中的AgNPs，稀釋一定倍數(shù)后，采用SP-ICP-MS法測(cè)定。本方法分析速度快，靈敏度高，可快速測(cè)定牙膏中的AgNPs粒徑分布、數(shù)量濃度和質(zhì)量濃度。

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