孫昂昂，劉東璞

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154000；2.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000)

HF是慢性損傷長(zhǎng)期反復(fù)刺激肝臟的反應(yīng)過(guò)程，基本因素是肝細(xì)胞的壞死，中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活與增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠60只(180～220 g)，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，大黃酸粉劑，高壓氧裝置，兔抗鼠TGF-β1抗體、α-SMA抗體，萊卡光學(xué)顯微鏡

1.2 方法

空白對(duì)照組(O組)：僅花生油腹腔注射及生理鹽水灌胃；

模型對(duì)照組(S組)：首次以 3 mL/kg CCL 4溶液(精制花生油配置)腹腔注射，以后均 2 mL/kg 腹腔注射，2次/周，共6周；

大黃酸治療組(R組)：誘導(dǎo)肝損傷同模型組，首次腹腔注射 CCL 4油劑三天后大黃酸灌胃100 mg/kg，2次/周；

高壓氧治療組(H組)：誘導(dǎo)肝損傷同模型組，首次腹腔注射 CCL 4油劑三天后高壓氧1 kPa 1 h/次，2次/周；

大黃酸聯(lián)合高壓氧治療組(RH組)：誘導(dǎo)肝損傷同模型組，在給予高壓氧的同時(shí)給予大黃酸，時(shí)間和劑量不變。

每7天處死1只模型對(duì)照組取肝臟組織作肝臟病理學(xué)檢查，按照《病毒性肝炎防治方案》評(píng)判肝纖維化程度[1]，直到模型建立成功。

肝功能檢測(cè)于造模成功后分別尾靜脈采血，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST。

HE染色6周造模成功后，處死取大鼠同一部位肝組織，制備石蠟切片、HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變。

1.3 免疫組化法檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，免疫組化檢測(cè)TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)，均定位在胞質(zhì)，為棕黃色顆粒樣著色。采用IPP 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件，數(shù)據(jù)以 x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P< 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中ALT、AST水平

各實(shí)驗(yàn)組均較O組升高(P<0.05)，說(shuō)明肝臟均有不同程度的損傷；S組表達(dá)增加，H組、RH組較S組升高(P<0.05)，R組較S組降低(P<0.05)；RH組較H組降低，較R組升高(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST水平

注：*表示與O組比較，P<0.05；#表示與S組比較，P<0.05；△表示與RH組比較，P<0.05。

2.2 肝臟病理學(xué)改變

O組肝小葉結(jié)構(gòu)正常；H組大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生明顯，分割破壞肝小葉；RH組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生僅次于H組；S組纖維組織有纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)部分存在；R組匯管區(qū)和周圍纖維組織輕度增生(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理改變(×400)

2.3 免疫組化結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較O組升高(P<0.05)，S組表達(dá)增加，H組、RH組較S組升高(P<0.05)，R組較S組降低(P<0.05)；RH組較H組降低，較R組升高(P<0.05)(見(jiàn)表2，圖2、3)。

表2 免疫組化檢測(cè)肝臟組織TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

注：*表示與O組比較，P<0.05；#表示與S組比較，P<0.05；△表示與RH組比較，P<0.05。

圖2 各組大鼠肝臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)(×400)

圖3 各組大鼠肝臟組織α-SMA蛋白表達(dá)(×400)

3 討論

各實(shí)驗(yàn)組血清ALT、AST檢測(cè)均較O組升高，說(shuō)明肝臟有不同程度的損傷；HE染色：各實(shí)驗(yàn)組均有不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生，間隔形成；肝功能血清學(xué)檢測(cè)和病理學(xué)改變表明肝纖維化模型制備成功。

TGF-β1，是最廣泛和最深入研究的亞型，也是最強(qiáng)的致肝纖維化因子，是介導(dǎo)肝損傷及纖維化的最關(guān)鍵的細(xì)胞因子[2]，肝損傷后，TGF-β1表達(dá)會(huì)顯著增加。

HSC受細(xì)胞因子或炎癥因子刺激，引起表型改變，遷移復(fù)位產(chǎn)生過(guò)量的α-SMA，被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)病的關(guān)鍵事件。故α-SMA可作為HSC活化的特有標(biāo)志性蛋白[3]。

各實(shí)驗(yàn)組TGF-β1、 α-SMA蛋白均較O組升高，S組蛋白表達(dá)增加，H組、RH組較模型組升高，R組較模型組降低，RH組較H組降低；表明大黃酸可以抑制肝纖維化，其作用機(jī)制與其抗氧化、抗炎作用有關(guān)，拮抗CCL4的毒性作用，抑制TGF-β1的活性及抑制HSC活化、抗肝細(xì)胞凋亡壞死、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成等方面有關(guān)[5]。

研究表明，肝硬化病人30%～70%存在局部氧供應(yīng)不足的現(xiàn)象，供血及供氧不足會(huì)導(dǎo)致肝損傷加重[6]，影響細(xì)胞內(nèi)線粒體的代謝，而高壓氧治療可以迅速改善組織缺氧。但是，本實(shí)驗(yàn)中H組肝纖維化加重，RH組肝損傷較S組重，說(shuō)明高壓氧加重肝損傷大于大黃酸的抑制肝纖維化作用。可能與以下研究有關(guān)，CCL 4可以與氧氣反應(yīng)生成CCL3O2·，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用和細(xì)胞膜破壞，處于高壓氧狀態(tài)下會(huì)生成更多的CCL3O2·，損傷肝細(xì)胞[7]；單用高壓氧導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基增多，故需聯(lián)用自由基清除劑[6]；在高壓氧腎移植后缺血再灌注治療中5 h組血清肌酐較1 h、3 h組低[8]，因高壓氧使用時(shí)間不同而產(chǎn)生結(jié)果的差異。Nakai，Sun Y[9-10]等國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)已有論述高壓氧可以迅速改善組織缺氧、減輕肝細(xì)胞損傷和炎癥化，可以從以上幾個(gè)方面繼續(xù)探究實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期的差異，進(jìn)一步深入研究，為肝纖維化藥物的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。