閆甜甜，王曉瑜，彭桂新，張峻嶺，王寶林，陳 黎，潘立寧，賈國濤，姚 倩，謝復(fù)煒*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001 2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)開區(qū)第三大街8 號 450000

煙草中的醛酮類化合物是一類重要香味成分，與煙草感官品質(zhì)和風(fēng)味緊密相關(guān)［1］。如，5-甲基糠醛具有甜香，可增加煙氣豐滿度；β-大馬酮具有強烈的玫瑰清甜香氣，可賦予煙草特征香氣［2］。對國內(nèi)外煙用添加劑清單、煙用天然香原料的剖析類文獻(xiàn)和煙草煙氣香味成分定性分析文獻(xiàn)［2-5］進行系統(tǒng)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)煙草及煙用添加劑中醛酮類香味成分已超過150 種。因此，建立準(zhǔn)確、高通量、快速的煙草醛酮類香味成分檢測方法對卷煙產(chǎn)品的開發(fā)與維護具有重要指導(dǎo)意義。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）作為分析復(fù)雜樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分的主要工具，目前已廣泛應(yīng)用于煙草、藥物及食品等領(lǐng)域［6-8］；但在分析復(fù)雜樣品時，可能由于特征離子存在干擾或目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，定性及定量上存在假陽性風(fēng)險［9］。氣相色譜-四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜（GC-QTOF MS）在對目標(biāo)化合物進行準(zhǔn)確定量、快速篩查及未知化合物結(jié)構(gòu)鑒定等方面具有明顯優(yōu)勢［10］：一是因TOF 分辨率高、掃描速度快而具有高的質(zhì)量精確度，通過窄的質(zhì)量窗口提取，可以排除基質(zhì)干擾［11］；二是一級全掃描模式數(shù)據(jù)采集簡單方便，不受掃描時間段和掃描離子個數(shù)限制，可采集樣品全部信息，用于數(shù)據(jù)存檔。在后期數(shù)據(jù)處理時，可根據(jù)不同需要編輯相應(yīng)的定性定量方法對樣品進行分析［12］。文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果表明，目前GC-QTOF MS 的相關(guān)研究集中在對農(nóng)藥殘留的篩查［13-15］和復(fù)雜樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量分析［16-17］方 面。2017 年Chen 等［17］采 用GC-QTOF MS 法對煙葉中115 種農(nóng)藥殘留進行了準(zhǔn)確定性定量分析。

本研究中通過優(yōu)化色譜方法、精確質(zhì)量提取窗口，基于高分辨GC-QTOF MS 構(gòu)建了煙草及煙草制品中127 種醛酮類香味成分的定量分析方法；并用該方法檢測了15 個品牌卷煙煙絲中的醛酮類香味成分，旨在為煙草醛酮類香味成分分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

云南曲靖2016 年產(chǎn)C3F 等級煙葉；15 個市售國產(chǎn)品牌卷煙樣品。

QuEChERS 萃 取 試 劑 盒（4 g MgSO4+ 1 g NaCl，美國Agilent 公司）；53 種醛類和74 種酮類標(biāo)準(zhǔn)品（＞95%，美國Sigma-Aldrich 公司、日本TRC公司、北京百靈威科技有限公司、東京化成工業(yè)株式會社）；正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品C7～C40（溶劑為正己烷，美國Sigma 公司）；苯乙酮-d8（98 atom% D，美國Sigma-Aldrich 公司）；乙腈（色譜純，美國J T Baker公司）。

7890A-7200 GC-QTOF MS 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；3-30KS 高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；EOFO-945066 多管式旋渦混合器（美國Talboys 公司）；Quintix 224-1CN 電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

稱取2.00 g 煙末樣品，加入10 mL 磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH 為3，泡發(fā)5 min，加入10 mL 乙腈以及80 μL 30.0 mg/L 苯乙酮-d8內(nèi)標(biāo)工作液，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速渦旋10 min，放入-18 ℃的冰箱中冷凍10 min；取出后加入QuEChERS 萃取試劑盒（4 g MgSO4+ 1 g NaCl），再以2 500 r/min 的轉(zhuǎn)速渦旋2 min，7 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min；取1.5 mL 上清液，加入0.2 g 無水硫酸鎂，立即以2 500 r/min 的轉(zhuǎn)速渦旋2 min，7 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心3 min；將上清液過0.22 μ m 有機相濾膜，然后分別進行GC-QTOF MS 和GC-MS 分析。

1.2.2 GC-QTOF MS 和GC-MS 分析條件

GC-QTOF MS 分析條件：

色譜柱：DB-5MS UI 彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口端串聯(lián)預(yù)柱（5 m ×0.25 mm）；載氣：高純He，純度99.999%；恒流模式流速：1.5 mL/min；進樣口溫度：290 ℃；進樣模式：不分流進樣；進樣量：0.8 μL；升溫程序：50 ℃（3 min）5℃/min75 ℃（1 min）1℃/min150 ℃（1 min）2℃/min260℃（1 min）10℃/min290 ℃（10min）。離子源：電子轟擊（EI）；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；掃描模式：一級全掃描；質(zhì)量掃描范圍：50～300 amu；采集速率：5 spectra/s。

GC-MS分析條件：

色譜條件同GC-QTOF MS；離子源：電子轟擊（EI）；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：33～300 amu；掃描速率：Normal。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-QTOF MS 條件優(yōu)化

通過對國內(nèi)外煙用添加劑清單、煙用天然香原料的剖析文獻(xiàn)以及煙草和煙氣香味成分定性分析文獻(xiàn)進行系統(tǒng)調(diào)研，購買了139 種醛酮類香味成分標(biāo)準(zhǔn)品。其中甲乙酮、異丁醛等12 種小分子醛酮類香味成分由于穩(wěn)定性差、靈敏度低等原因需要通過衍生化分析，因此本研究中共對127 種可直接提取分析的醛酮類香味成分進行分析。

采用本實驗室已建立的方法對煙草樣品進行前處理［18］，對比二氯甲烷和乙腈的提取效果。結(jié)果表明采用乙腈的提取效率高于二氯甲烷，如，茄酮、β-紫羅蘭酮、樟腦和苯甲醛采用乙腈的提取效率分別為二氯甲烷的4、2、1.5 和4.5 倍。在已建立方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化了色譜條件，實現(xiàn)了一次進樣對所有目標(biāo)物的分析。

GC-QTOF MS 能夠以精確質(zhì)量進行數(shù)據(jù)采集。在進行數(shù)據(jù)分析時，合適的質(zhì)量提取窗口可去除干擾離子、提高靈敏度，使定性、定量更加準(zhǔn)確，因此，優(yōu)化了質(zhì)量提取窗口。在加標(biāo)1 000 ng/mL的煙草樣品基質(zhì)中，考察了順-4-庚烯醛、5-甲基糠醛、苯乙醛、反-2-己烯醛、2-萘乙酮和對甲基苯乙酮在不同質(zhì)量提取窗口下，各化合物的響應(yīng)面積和信噪比。結(jié)果表明，隨質(zhì)量窗口變窄，各化合物響應(yīng)面積減小，信噪比提高。在質(zhì)量提取窗口為3 至10 mDa 時，化合物響應(yīng)及信噪比穩(wěn)定，且信噪比相對較大。圖1a 和圖1b 分別為反-2-己烯醛在不同質(zhì)量提取窗口下提取特征離子精確質(zhì)量83.049 1 Da 所得峰面積和信噪比值。對于化合物響應(yīng)較低的情況，以煙草樣品中的對甲基苯甲醛（特征離子m/z 120.057 0）為例，比較了質(zhì)量提取窗口為3 至10 mDa 的色譜圖（圖2）。質(zhì)量窗口為5 mDa（圖2c）和10 mDa（圖2d）時色譜峰峰形較好。綜合考慮不同豐度化合物的響應(yīng)面積和信噪比等因素，質(zhì)量提取窗口設(shè)定為5 mDa。

圖1 反-2-己烯醛在不同質(zhì)量提取窗口下化合物豐度及信噪比Fig.1 Compound abundances and signal-to-noise ratios at different mass extraction windows of (E)-2-hexenal

圖2 對甲基苯甲醛在不同質(zhì)量提取窗口的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 4-methylbenzaldehyde at different mass extraction windows

2.2 醛酮類香味成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的創(chuàng)建及應(yīng)用

采用高分辨GC-QTOF MS 對糠醛、β-大馬酮等127 種醛酮類香味成分進行分析，創(chuàng)建了煙草中醛酮類香味成分的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫包含每種醛酮類香味成分的高分辨質(zhì)譜圖、保留指數(shù)和精確相對分子質(zhì)量等信息。首先采用高分辨GC-QTOF MS 分析目標(biāo)醛酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品得到其一級全掃質(zhì)譜圖和保留時間，根據(jù)保留時間，以正構(gòu)烷烴系列為參考，計算目標(biāo)化合物的保留指數(shù)，采用Agilent MassHunter PCDL Manager 軟件建立醛酮類香味成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。圖3a 和圖3b 分別為數(shù)據(jù)庫中苯乙醛和水楊醛的質(zhì)譜圖，質(zhì)譜圖中包含各碎片離子的精確離子質(zhì)量和相對豐度。數(shù)據(jù)庫中其他化合物信息見表1，經(jīng)驗證，各化合物精確質(zhì)量誤差均小于2 mDa。由于該數(shù)據(jù)庫包含每種醛酮香味成分的保留指數(shù)和精確特征離子質(zhì)量，在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下也可以對醛酮類香味成分進行準(zhǔn)確定性，因此該數(shù)據(jù)庫具有廣泛的實際應(yīng)用價值。

圖3 數(shù)據(jù)庫中苯乙醛和水楊醛的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of benzeneacetaldehyde and 2-hydroxybenzaldehyde in the database

表1 127 種醛酮類香味成分理論質(zhì)量、數(shù)據(jù)庫中質(zhì)量、質(zhì)量誤差和保留指數(shù)Tab.1 Theoretical masses, measured masses in the database, mass errors and retention indexes of 127 aldehyde and ketone aroma components

表1（續(xù)1）

表1（續(xù)2）

表1（續(xù)3）

在對實際樣品進行定性分析時，可通過實際質(zhì)譜圖與高分辨質(zhì)譜圖匹配鑒定醛酮類香味成分。也可使用Agilent MassHunter 定性分析軟件中“按分子式查找”對化合物進行定性，設(shè)定目標(biāo)源為建立的醛酮類香味成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，質(zhì)量提取窗口為5 mDa，進行精確質(zhì)量提取，以兩個以上特征離子準(zhǔn)確檢出，特征離子豐度比和保留時間/指數(shù)與數(shù)據(jù)庫中一致作為定性依據(jù)，該定性依據(jù)符合歐盟質(zhì)譜方法定性確證標(biāo)準(zhǔn)［20］。如苯乙醛與水楊醛的保留時間分別為20.55 和20.59 min，其特征離子見表2。在煙絲樣品中，保留時間20.59 min 對應(yīng)的質(zhì)譜圖如圖4a 所示，由于水楊醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，特征離子質(zhì)譜豐度低于500（圖4b），采用NIST 質(zhì)譜庫匹配時，僅可匹配到苯乙醛。采用定性軟件進行查找時，苯乙醛和水楊醛均可準(zhǔn)確定性。圖5為水楊醛的特征離子提取離子流圖，特征離子豐度比與數(shù)據(jù)庫中一致（圖3b）。由表2 可知，煙絲樣品中干擾離子質(zhì)量誤差小于500 mDa，采用傳統(tǒng)GC-MS 提取時無法去除干擾離子，高分辨GC-QTOF MS 法定性更加準(zhǔn)確。

表2 苯乙醛和水楊醛的特征離子信息Tab.2 Information of characteristic ions of benzeneacetaldehyde and 2-hydroxybenzaldehyde

圖4 在煙絲樣品中保留時間20.59 min 處峰的質(zhì)譜圖和水楊醛的特征離子質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of peak and characteristic ions of 2-hydroxybenzaldehyde at retention time 20.59 min in cut tobacco sample

圖5 在煙絲樣品中水楊醛的特征離子提取離子流圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of characteristic ions of 2-hydroxybenzaldehyde in cut tobacco sample

2.3 GC-QTOF MS 定量分析

GC-QTOF MS 能夠以精確質(zhì)量進行全掃描并通過窄的質(zhì)量窗口提取去除干擾離子峰、提高信噪比，使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。通過對比樟腦和2-乙?；?5-甲基呋喃在傳統(tǒng)GC-MS 與高分辨GC-QTOF MS 條件下的提取離子流圖，證明采用GC-QTOF MS 法通過窄的質(zhì)量窗口提取可提高靈敏度，去除干擾離子。煙草樣品中樟腦（特征離子m/z 98.085 5）的保留時間為31.03 min，圖6a 是傳統(tǒng)GC-MS 提取質(zhì)量數(shù)95 Da 的離子流圖，由于背景噪音過大，無法識別化合物信號。在GC-QTOF MS 全掃描條件下，設(shè)定質(zhì)量提取窗口為±500 mDa時，化合物信噪比小于3（圖6b）。當(dāng)質(zhì)量提取窗口縮小到±5 mDa 時，信噪比明顯提高（圖6c）。煙草樣品基質(zhì)中2-乙?；?5-甲基呋喃（特征離子m/z 109.028 4）的保留時間為20.60 min，圖7a 為傳統(tǒng)GC-MS 提取質(zhì)量數(shù)109 Da 的色譜圖，在其右側(cè)出現(xiàn)較大干擾峰。以±500 mDa 質(zhì)量窗口提取的色譜圖（圖7b）與傳統(tǒng)GC-MS 色譜圖一樣有較大干擾。圖7b 中1#色譜峰的質(zhì)譜圖如圖8a 所示，基質(zhì)中2-乙?；?5-甲基呋喃的特征離子精確質(zhì)量為109.027 3 Da。2#干擾峰中干擾離子的精確質(zhì)量為109.059 3 Da（圖8b），與目標(biāo)離子精確質(zhì)量109.028 4 Da 相差30.9 mDa，當(dāng)質(zhì)量提取窗口為±5 mDa 時，可去除干擾離子109.059 3 Da（圖7c），使定量更加準(zhǔn)確。

在對目標(biāo)醛酮類化合物進行定量分析中，質(zhì)量提取窗口為±500 mDa 時，2,2,6-三甲基環(huán)己酮、2,3-二甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮等12 種目標(biāo)醛酮化合物存在干擾。當(dāng)質(zhì)量提取窗口為±5 mDa 時，可以去除干擾，實現(xiàn)對目標(biāo)醛酮準(zhǔn)確定量分析。

圖6 樟腦在GC-MS 和GC-QTOF MS 全掃描模式下提取的離子流圖Fig.6 Extracted ion chromatograms of camphor by GC-MS and GC-QTOF MS under full scan mode

圖7 2-乙?；?5-甲基呋喃在GC-MS 和GC-QTOF MS 全掃描模式下提取的離子流圖Fig.7 Extracted ion chromatograms of 2-acetyl-5-methylfuran by GC-MS and GC-QTOF MS under full scan mode

圖8 圖7b 中1#和2#號色譜峰的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectra of 1# and 2# chromatogram peaks in Fig.7b

2.4 GC-QTOF MS 定量分析方法的建立與表征

為了減少基質(zhì)效應(yīng)［18］對醛酮類香味成分定量的影響，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，實驗過程中均以5～7 個標(biāo)準(zhǔn)濃度點繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍見表3。由于巨豆三烯酮、金合歡基丙酮等標(biāo)準(zhǔn)品為同分異構(gòu)體混合物，在定量分析中將同分異構(gòu)體合并計算。以苯乙酮-d8為內(nèi)標(biāo)校正儀器響應(yīng)，考察低、中、高3 個水平的加標(biāo)回收率和日內(nèi)精密度，并在中添加水平下進行日間精密度（n=6）考察，以10倍信噪比作為方法定量限。線性范圍、加標(biāo)回收率、定量限（LOQ）和日間精密度見表3。結(jié)果顯示，127 種醛酮類化合物均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99）。3 個添加水平下，平均回收率在61.8%～132.6%間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）（n=5）均小于20%，在低、中添加水平下，辛醛、苯甲醛、對甲基苯甲醛的平均回收率高于120%，十一醛、麝香酮等9 種化合物的平均回收率低于70%?？赡苡捎谀繕?biāo)化合物數(shù)量較多，實驗中采用單一內(nèi)標(biāo)校正，無法保證所有化合物的分析條件均為最佳條件；此外，在濃度較低時，部分化合物存在吸附現(xiàn)象。所有化合物的日間RSD（n=6）均小于20%，其中115 種化合物的日間RSD 小于10%。有95 種醛酮化合物的LOQ 在6～100 μg/kg 之間，21 種化合物的LOQ 在100～500 μg/kg 之間，11 種化合物的LOQ 在500～5 000 μg/kg 之間。該方法線性關(guān)系、回收率和精密度均良好，可滿足實際卷煙煙絲樣品中半揮發(fā)性醛酮類香味成分的分析。

由于GC-QTOF MS 法需要以精確質(zhì)量掃描樣品中全部離子，與進行選擇性離子檢測的傳統(tǒng)GC-MS法的SIM模式和GC-MS/MS 法的MRM 掃描模式相比，靈敏度較低［16］。對比63 種醛酮類化合物的定量限（表3），可知GC-MS/MS 的MRM 掃描模式下定量限低于100 μg/kg 的化合物有62 種，而GC-QTOF MS 全掃描模式下定量限低于100 μg/kg 的化合物有49 種。

表3 127 種醛酮類化合物的線性范圍、回收率（n=5）、日間精密度和定量限①Tab.3 Linear ranges, recoveries (n=5), inter-day precision (RSDs) and limits of quantification (LOQs)of 127 aldehyde and ketone compounds

表3（續(xù)1）

表3（續(xù)2）

2.5 卷煙煙絲樣品分析

采用已建立的方法對國內(nèi)15 個品牌卷煙煙絲樣品的分析結(jié)果見表4。15 個品牌卷煙煙絲共檢測到63 種醛酮類香味成分，包括22 種醛和41 種酮。3-庚烯-2-酮、鄰甲基苯甲醛、對甲氧基苯乙酮等可能由于在煙絲中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于本方法定量限而未檢出。定量結(jié)果顯示，卷煙煙絲中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是茄酮，其次是巨豆三烯酮、苯乙醛和糠醛。59 種醛酮類化合物在15 個品牌卷煙煙絲中均有檢出，其中不同品牌中煙酮、苯甲醛等14種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最大值為最小值的兩倍以上。乙基香蘭素、乙基麥芽酚、乙基環(huán)戊烯醇酮和紫蘇醛4 種化合物可能為添加的香味成分，僅在部分樣品中有檢出，其樣品數(shù)分別是7、11、3 和2 個。

乙基香蘭素在1#～4#、10#、12#、13#號樣品中有檢出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.15～0.65 mg/kg 之間。乙基環(huán)戊烯醇酮僅在1#、2#和11#號樣品中有檢出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.84、2.75 和0.63 mg/kg。紫蘇醛僅在8#和9#號樣品中有檢出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.96 和0.80 mg/kg。乙基麥芽酚在1#～11#號樣品中有檢出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.16～33.8 mg/kg 之間，8#和9#號樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.2 和33.8 mg/kg，其他樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于3.81 mg/kg。從以上結(jié)果可知，不同卷煙煙絲樣品在加香加料方面有差異。

表4 15 個不同品牌卷煙煙絲中醛酮類香味成分分析結(jié)果①Tab.4 Analysis results of aldehyde and ketone aroma components in cut tobacco samples of 15 cigarette brands

3 結(jié)論

①基于高分辨GC-QTOF MS 建立了127 種醛酮類香味成分的數(shù)據(jù)庫和準(zhǔn)確定量分析方法，與傳統(tǒng)GC-MS 全掃描模式相比，GC-QTOF MS 通過精確質(zhì)量提取可去除干擾離子，提高靈敏度，實現(xiàn)煙絲中醛酮類香味成分的準(zhǔn)確分析。②由于GC-QTOF MS 需要以精確質(zhì)量掃描樣品中全部離子，該方法比GC-MS/MS 的MRM 模式靈敏度低。③該方法具有高通量、定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)點，可用于煙草中醛酮類半揮發(fā)性香味成分的分析。