張浩然 徐 汀 張亦菲 田 愷 華賢輝 黃家鶯*（上海市獸藥飼料檢測所，上海201103）

25- 羥基維生素D3（25-OH-D3），是維生素D3在機體內(nèi)的首個代謝產(chǎn)物，更易被吸收[1]。目前，25-OH-D3已廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，用于提高蛋殼質(zhì)量[2]、提高母豬懷孕率及窩產(chǎn)仔數(shù)[3-4]等。目前關(guān)于飼料中25-OH-D3含量測定的報道僅限于配合飼料及濃縮飼料[5-6],至于預(yù)混合飼料方面，仍為空白。此外，維生素預(yù)混合飼料中25-OH-D3的含量高，用量大，又是配合飼料和濃縮飼料中25-OH-D3的來源。因此，本文建立了維生素預(yù)混合飼料中25-OH-D3含量測定的方法以期為維生素預(yù)混合飼料的質(zhì)量控制提供技術(shù)手段。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑高效液相色譜儀（ACQUITY Arc，Waters 公司）；電子天平（AB265-S，梅特勒- 托利多公司，精度為0.01 mg）。25-OH-D3標準品（Dr. Ehrenstorfer 公司，純度為98.2%，批號為G155330）；甲醇為色譜純；試驗用水為一級水；維生素預(yù)混合飼料樣品來自于市場收集。

1.2 色譜條件采用Thermo AQUASIL-C18色譜柱（規(guī)格為100 mm×3.0 mm，粒徑3 μm），檢測波長為264 nm；50 μL進樣；柱溫箱溫度為30℃；流動相：A 相為水，B 相為甲醇，梯度洗脫程序見表1。

1.3 試樣溶液的制備稱取維生素預(yù)混合飼料3 g 置于50 mL 棕色容量瓶中，加水10 mL，超聲10 min，冷卻；繼續(xù)加入30 mL 甲醇，混勻，超聲提取20 min，冷卻，用甲醇定容，稀釋至刻度，搖勻；移取20 mL 于離心管中，離心5 min（6000 轉(zhuǎn)/min）取上清，過0.22 μm 濾膜，得到試樣溶液。

1.4 標準儲備溶液的制備稱取25-OH-D3標準品25 mg，置于25 mL 棕色容量瓶中，加入適量甲醇，振搖使25-OH-D3溶解，用甲醇定容。于-20℃保存。

1.5 標準系列溶液制備移取標準儲備溶液適量，用85%甲醇溶液逐級稀釋至棕色容量瓶中，使?jié)舛确謩e為25 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.05 μg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性與范圍以濃度（x）為橫坐標，相應(yīng)峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性方程為y = 133964x -11009，相關(guān)系數(shù)為0.9998。結(jié)果表明，本方法在0.05μg/mL～25 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性良好。

2.2 方法的檢測限和定量限向空白基質(zhì)中添加25-OH-D3對照品，按照本文1.3 前處理后，以信噪比大于等于3 的濃度作檢出限，信噪比大于等于10 的濃度作定量限，確定了本方法的檢出限為0.2 mg/kg，定量限為1 mg/kg。

表1 梯度洗脫表

2.3 方法的準確度和精密度以空白基質(zhì)添加的方式，從50 mg/kg、150 mg/kg、300 mk/kg 三個不同濃度考察方法的準確度及精密度。結(jié)果表明，各濃度添加的回收率在87.9%～94.2%之間，RSD 在0.6%～2.2%之間結(jié)果見表2。

表2 方法準確度及精密度的試驗結(jié)果（n=5）

表3 實際樣品測定結(jié)果數(shù)據(jù)表（n=3）

2.4 樣品測定采用本法對各類維生素預(yù)混合飼料樣品進行測定。為確保結(jié)果準確，對各樣品進行了本底濃度的加標。結(jié)果表明，維生素預(yù)混合飼料的測定結(jié)果在32.5 mg/kg ～220.8 mg/kg 之間，本底加標回收率在86.6%～94.8%之間，說明本法適用于維生素預(yù)混合飼料中25-OH-D3的含量測定，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

上述結(jié)果表明，本方法線性良好，具有較好的準確度及精密度，可用于測定維生素預(yù)混合飼料中25-OH-D3的含量。