陳彩霞，馬春英，李先恩，付靜，張志強，趙晨光，侯俊玲，王文全，

1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.河北農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，河北 保定 071000；3.北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101301；4.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；5.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 102488

知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.為百合科多年生草本植物，以干燥根莖入藥，為我國常用大宗中藥材，歷版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)均有收錄，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效[1]。知母主要化學成分為皂苷類和雙苯吡酮類化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明，知母具有抗血小板血栓、改善阿爾茨海默癥、抗腫瘤、抗炎、解熱等作用[2]。其中知母皂苷AⅢ和BⅡ在抗老年癡呆方面有較好的療效，且知母皂苷AⅢ 通過誘導細胞凋亡的途徑可成為較好的抗癌藥物或先導化合物[3-4]，因此具有較高的研究價值和良好的開發(fā)前景。

知母藥材生產(chǎn)通常采用育苗1年，移栽1～2年的栽培方式，種苗質(zhì)量與植株生長發(fā)育、藥材產(chǎn)量及品質(zhì)密切相關(guān)[5]。于福來等[6]以種球直徑和側(cè)根數(shù)為質(zhì)量指標制定了知母種苗質(zhì)量分級標準，田間試驗證明不同等級種苗產(chǎn)出的藥材在化學成分含量上存在差異；馬春英等[7]利用種苗的單株質(zhì)量、須根數(shù)和種球直徑確定了西陵知母的種苗質(zhì)量等級標準。產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，知母種苗移栽易成活，從春季土壤解凍到雨季7—8月均可移栽種植。一般具有灌溉條件的基地，多集中在春季4中旬左右種植。沒有灌溉條件的山地，多選擇在6月初進入雨季后及時種植。不同種植時期、不同批次的知母種苗質(zhì)量可能存在差異。已有關(guān)于知母種苗的質(zhì)量標準多以春季種植的種苗為主，不能涵蓋整個種植時期的種苗質(zhì)量。為規(guī)范知母種苗流通標準，使知母種苗質(zhì)量分級標準更科學、簡單易行且對生產(chǎn)有指導意義，本研究通過調(diào)查春季、雨季知母種植基地及市場銷售種苗的質(zhì)量相關(guān)指標，參考種植生產(chǎn)以及市場流通種苗的選擇標準，確定種球直徑和百株質(zhì)量為知母種苗的質(zhì)量分級指標，并通過K-均值聚類分析對收集種苗進行初步等級劃分，以各等級種苗為試驗材料進行田間對比種植，連續(xù)2年追蹤調(diào)查移栽后植株生長動態(tài)、藥材產(chǎn)量及品質(zhì)狀況，驗證知母種苗質(zhì)量標準的合理性與可行性，以期為知母藥材的規(guī)范化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

知母種苗材料收集主要根據(jù)種植生產(chǎn)和市場交易相對集中的春季和雨季分2個時期進行。 2017年4月上旬收集安國種苗基地及市場銷售的1年生知母種苗共1004株，6月上旬收集市場銷售的種苗3200株，作為研究材料，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所王文全研究員鑒定，為百合科植物知母A.asphodeloidesBge.的種苗。

1.2 方法

1.2.1 種苗基地田間收集與調(diào)查方法 4月初選擇知母主產(chǎn)區(qū)的種苗基地，設(shè)置4個大小為2 m×2 m的樣方，每個樣方隨機抽取50株種苗，共計200株，分別對其株高(cm)、地莖(蘆頭上部接近地面處的直徑cm)、種球直徑(mm)、側(cè)根數(shù)(個)、單株質(zhì)量(g)進行測定。

1.2.2 藥材市場銷售種苗質(zhì)量調(diào)查 4月上旬按照藥材市場的種苗銷售標準，分別收集不同等級種苗，其中Ⅰ級苗10 kg、Ⅱ級苗5 kg、Ⅲ級苗2.0 kg、Ⅳ級苗1.0 kg，保證每類種苗200株左右，共收集種苗804株。分別對其株高、種球直徑、地莖、側(cè)根數(shù)、單株質(zhì)量等質(zhì)量指標進行檢測。6月上旬分別收集Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級不同等級種苗各800株，共計3200株，主要根據(jù)市場交易標準進行了百株質(zhì)量、單株質(zhì)量測定以及實際種植時的單株質(zhì)量。

種苗質(zhì)量指標確定及初步等級劃分 依據(jù)收集的知母種苗質(zhì)量指標測定數(shù)據(jù)，利用相關(guān)性分析、主成分分析，并結(jié)合種苗市場流通和生產(chǎn)實際標準，確定知母種苗的質(zhì)量分級指標，通過K-均值聚類分析，對知母種苗進行質(zhì)量等級的初步劃分。

1.2.3 不同等級種苗田間對比栽培試驗 將不同等級種苗種植于河北安國種苗基地，試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，每小區(qū)6 m2，3次重復，移栽株行距為20 cm×25 cm，小區(qū)間設(shè)置50 cm空地作為隔離行。移栽后澆透水，進行常規(guī)田間管理，未施用任何肥料。

1.2.4 不同等級種苗產(chǎn)量和藥用成分含量測定 連續(xù)2年于秋季進行知母植株保存率和藥材產(chǎn)量相關(guān)指標的調(diào)查測定。每小區(qū)隨機選取30樣株，3次重復。對種植2年收獲的藥材清洗干凈后55 ℃烘箱干燥后粉碎，根據(jù)《中國藥典》進行有效成分含量檢測。所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 知母種苗質(zhì)量指標調(diào)查

根據(jù)知母種苗質(zhì)量特點，并結(jié)合生產(chǎn)實踐，對影響知母種苗質(zhì)量的株高(葉長)、側(cè)根數(shù)、單株質(zhì)量、地莖和種球直徑5個質(zhì)量指標進行了測定，統(tǒng)計分析見圖1～5。

圖1 知母種苗株高的頻率分布

圖2 知母種苗側(cè)根數(shù)的頻率分布

圖3 知母種苗單株質(zhì)量的頻率分布

圖4 知母種苗地莖的頻率分布

圖5 知母種苗種球直徑的頻率分布

由圖1～5看出，知母種苗質(zhì)量指標株高、側(cè)根數(shù)、地莖及種球直徑都遵循正態(tài)分布。單株質(zhì)量的頻數(shù)分布中0～20 g的植株所占比例較高，這可能與市售知母種苗主要以質(zhì)量為交易指標有關(guān)。實地調(diào)研知母種苗市場銷售現(xiàn)狀發(fā)現(xiàn)，相同質(zhì)量條件下，種苗越小，種苗數(shù)量越多，為降低生產(chǎn)成本，藥農(nóng)更傾向于購買植株個體小的種苗，因此導致市場銷售種苗普遍偏小，而市場收集種苗在本次調(diào)查種苗中所占比例較高(約為80%)，進而使所有調(diào)查種苗單株質(zhì)量的頻數(shù)分布有所偏差。所有知母種苗質(zhì)量指標的調(diào)查結(jié)果描述統(tǒng)計量見表1。

表1 知母種苗質(zhì)量指標描述統(tǒng)計量(n=1004)

注：因知母為基生葉，株高指葉片長。

表1數(shù)據(jù)顯示，知母種苗單株質(zhì)量的變異系數(shù)最大，為0.878 9，其次是側(cè)根數(shù)、地莖和種球直徑，株高的變異系數(shù)最小。不難看出，單株質(zhì)量、側(cè)根數(shù)、種球直徑及地莖對知母種苗質(zhì)量的影響更大。在評定種苗質(zhì)量時，測定指標越多，所得種苗質(zhì)量信息越完整，但在實際生產(chǎn)中，很難對每株苗的多個指標都進行檢測。由于各指標間具有一定相關(guān)性，多個質(zhì)量指標的信息往往是重疊的[8]。為保證質(zhì)量標準的制定即具科學性，又便于生產(chǎn)中操作，在制定知母種苗質(zhì)量標準時，必須選擇既能反映種苗質(zhì)量，又方便測量，且在種苗生產(chǎn)、交易過程中具有實際應用價值的因子作為知母種苗的質(zhì)量分級指標。

為明確知母種苗各質(zhì)量指標之間的相關(guān)性，對知母種苗的5項檢測指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。

表2 知母種苗5項質(zhì)量指標的相關(guān)性分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

表2數(shù)據(jù)表明，種球直徑與其他各項質(zhì)量指標均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，其中與地莖間相關(guān)系數(shù)最高，為0.880，與單株質(zhì)量、側(cè)根數(shù)及株高的相關(guān)系數(shù)分別為0.745、0.589和0.145。單株質(zhì)量與地莖、側(cè)根數(shù)和株高也呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.718，0.672和0.351。相關(guān)分析結(jié)果表明，知母種苗各檢測指標之間存在重疊，可通過主成分分析法，結(jié)合生產(chǎn)實踐確定知母種苗的主要分級指標。

2.2 知母種苗質(zhì)量指標的確定

為確定影響知母種苗質(zhì)量的主導因子，對種球直徑、單株質(zhì)量、側(cè)根數(shù)、地莖、株高5個指標進行了主成分分析，結(jié)果見表3。

表3 主成分特征值、貢獻率及累計貢獻率

主成分分析第一個特征向量為：

F=0.505X1+0.745X2+0.857X3+0.894X4+0.923X5

(1)

式中：X1代表株高，X2代表側(cè)根數(shù)，X3代表單株質(zhì)量，X4代表地莖，X5代表種球直徑。

表3結(jié)果表明，主成分1、2、3的貢獻率分別為63.92%、17.708%、9.822%，累計貢獻率已達到91.452%，說明前3個主成分基本包含了知母種苗全部的指標信息，可以很好的表達知母種苗的質(zhì)量。第一主成分中載荷最大的為種球直徑，其次是地莖>單株質(zhì)量>側(cè)根數(shù)>株高。前期研究中，于福來等[6]以種球直徑和側(cè)根數(shù)為質(zhì)量指標確定了知母種苗的分級標準。馬春英等[7]通過研究確定了西陵知母種苗的質(zhì)量分級指標為側(cè)根數(shù)、單株質(zhì)量和種球直徑。生產(chǎn)上種球直徑是反映根鮮重和種苗質(zhì)量的重要指標。相關(guān)性分析結(jié)果表明，種球直徑和地莖、側(cè)根數(shù)、單株質(zhì)量均呈極顯著正相關(guān)，為避免指標重疊，簡化檢測指標，種球直徑可考慮作為知母種苗質(zhì)量的決定性指標。種苗重量與種苗大小、健壯程度密切相關(guān)，是知母種苗市場流通中的重要指標，且常以百株質(zhì)量作為評估指標。為保證知母種苗質(zhì)量標準，既能科學反映種苗的基本性狀，又方便種苗交易且具有廣泛的商業(yè)應用價值，因此本研究擬采用種球直徑和百株質(zhì)量作為知母種苗質(zhì)量的分級指標，其中種球直徑為衡量知母種苗重量的決定性指標，百株質(zhì)量作為知母種苗質(zhì)量評價的參考指標。

2.3 知母種苗質(zhì)量初步分級

2.3.1 知母種苗質(zhì)量指標K-均值聚類分析 知母種苗質(zhì)量等級類型的劃分采用K-均值聚類分析法，按類間距距離大小依次對各指標進行質(zhì)量等級分類，單項因素分別K-均值聚類分析的最終類中心值見表4。以種球直徑和百株質(zhì)量(單株質(zhì)量×100)2個指標將知母種苗聚為3類(見表4)。

表4 知母種苗質(zhì)量分級指標最終聚類中心值

2.3.2 市場銷售知母種苗等級劃分標準分析 市場實地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，不同時期市場銷售的知母種苗均按照種苗質(zhì)量不同進行分類銷售。知母為根狀莖，葉由基部叢生，呈細長披針形，因此知母種苗地上部分實際為知母的葉片。生產(chǎn)中使用的知母種苗，均為前一年春季播種的種苗。根據(jù)知母的生物學特性，自春季萌發(fā)開始生長直至6月中旬，知母多通過消耗自身根系貯存的營養(yǎng)用于地上部分生長，因此隨著種植時期延后，知母種苗蘆頭直徑變化不大，主要表現(xiàn)在植株地上部分葉片的快速增長，進而導致種苗鮮質(zhì)量的迅速增加。為此，對6月初收集的來自市場銷售的不同等級種苗，主要進行了種苗質(zhì)量指標測定，結(jié)果見表5，以期為知母種苗質(zhì)量分級標準的制定提供參考依據(jù)。

表5 市售知母種苗不同等級質(zhì)量分布情況

隨著種植時期延后，地面溫度升高，知母種苗葉片面積過大容易造成植株失水萎蔫難以成活。實際種植過程中為保證成活率，減少葉片水分蒸發(fā)，種植戶多以地上部葉片長度不超過10 cm的標準進行種植。種植較早地上部分葉片不超過10 cm的可以不用修剪地上葉片?？梢姡煌N植時期市售知母種苗質(zhì)量差異較大，但實際種植時的種苗標準相近，這為制定知母種苗質(zhì)量標準提供了參考依據(jù)。表5中種植時種苗平均單株質(zhì)量是根據(jù)實際種植需要，減去部分地上部葉片時單株質(zhì)量的平均值。從數(shù)據(jù)看出，市售不同等級知母種苗種植時的百株質(zhì)量分別為Ⅰ級3.975 kg、Ⅱ級2.1 kg、Ⅲ級0.8 kg、Ⅳ級0.362 5 kg。按照每畝(1畝≈666.7 m2，下同)移栽8800株苗計算，Ⅰ級苗的使用量為176 kg，Ⅱ級苗使用量為132 kg，Ⅲ級苗使用量為88 kg，過于大的種苗因單位質(zhì)量種苗株數(shù)少導致生產(chǎn)成本過高，過小的Ⅳ級苗又會影響藥材產(chǎn)量，因此Ⅰ級種苗交易量很小，比較受歡迎的是Ⅱ級、Ⅲ級種苗，交易量最大。為了符合藥材種植戶的生產(chǎn)需求，降低生產(chǎn)成本，同時又能保證知母種苗質(zhì)量，在知母種苗標準制定時需對種苗的百株質(zhì)量進行一定限制。

2.3.3 知母種苗質(zhì)量標準的初步劃分 種球直徑是衡量知母種苗質(zhì)量的決定性指標，根據(jù)知母種苗質(zhì)量分級指標的最終聚類中心值，為便于生產(chǎn)應用，將其尾數(shù)采用四舍五入的方式進行修訂，得到各等級分類值為Ⅰ級1.2 cm，Ⅱ級0.8 cm，Ⅲ級0.5 cm。百株質(zhì)量根據(jù)最終聚類中心值，Ⅰ級1.989 kg，Ⅱ級1.436 kg，Ⅲ級0.957 kg，將各指標尾數(shù)采用0或5進位取整法進行修約，同時參考市場銷售不同等級種苗實際種植時的百株質(zhì)量值，對Ⅲ級種苗的最小值進行了限制，基本包括了知母實際種植生產(chǎn)中種苗等級Ⅱ級2.0 kg和Ⅲ級0.8 kg種苗，但為避免種苗過小影響藥材產(chǎn)量，對知母種苗百株質(zhì)量進行了限制。因此，知母種苗質(zhì)量等級初步劃分標準見表6。

表6 知母種苗質(zhì)量等級初步劃分標準

注：百株質(zhì)量是指種植時經(jīng)過適當剪葉處理(保留葉片長度不超過10 cm)100株種苗的質(zhì)量。

2.4 知母種苗分級種植對知母植株生長、藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的影響

對移栽種植1、2年后各等級種苗的存活率、種球直徑、單株根質(zhì)量等指標進行測定，結(jié)果見表7～8。對種植2年收獲的藥材烘干后粉碎，根據(jù)《中國藥典》方法對知母皂苷和芒果苷含量進行測定，結(jié)果見表9。

表7 不同等級種苗種植1年植株的生長狀況

注：表中同列不同小寫字母表示P<0.05(LSD檢驗)，下同。

表7數(shù)據(jù)結(jié)果表明，不同等級知母種苗種植1年后，植株存活率、種球直徑以及單株根質(zhì)量均有所不同。Ⅰ級、Ⅱ級種苗種植后經(jīng)過一個生長季植株的存活率沒有顯著差異，但均顯著大于Ⅲ級種苗的存活率；Ⅰ級種苗種植后的種球直徑顯著大于Ⅱ級、Ⅲ級，單株根質(zhì)量則是Ⅰ級種苗顯著大于Ⅱ級，Ⅱ級種苗顯著大于Ⅲ級。種球直徑是反映知母種苗根鮮質(zhì)量和種苗質(zhì)量的重要指標，種苗的質(zhì)量又與種苗大小、健壯程度密切相關(guān)，因此不同等級種苗導致種苗大小和健壯程度顯著不同，進而影響了植株的成活率和生長勢。

表8 不同等級種苗種植2年植株生長性狀表現(xiàn)

由表8可見，不同等級知母種苗種植2個生長季后，植株的存活率相對穩(wěn)定，種植初期的種苗等級劃分決定了種植2年后保存的株數(shù)不同進而導致藥材產(chǎn)量顯著不同，但同一等級種苗種植2年與種植1年的存活率差異無統(tǒng)計學意義。不同等級種苗在種植2個生長季后種球直徑差異無統(tǒng)計學意義，說明在一定生長空間內(nèi)，知母植株的生長會有更多的營養(yǎng)用于與藥材產(chǎn)量密切相關(guān)的根莖生長，進而表現(xiàn)在單株根鮮質(zhì)量的顯著不同。單株根鮮質(zhì)量表現(xiàn)在Ⅰ級種苗要優(yōu)于Ⅱ級、Ⅲ級的種苗，這與Ⅰ級種苗健壯、恢復生長快、生長勢強有關(guān)。不同等級知母種苗種植2年后收獲藥材鮮質(zhì)量表現(xiàn)為Ⅰ級>Ⅱ級>Ⅲ級，知母種苗等級劃分對知母藥材生產(chǎn)中穩(wěn)定產(chǎn)量具有重要意義。

對不同等級種苗種植2年后收獲的藥材進行品質(zhì)評價，結(jié)果見表9。不同等級知母種苗種植2年后，收獲的藥材均能達到《中國藥典》的質(zhì)量標準，即水分≤12.0%，總灰分≤9.0%，酸不溶性灰分≤4.0%，芒果苷質(zhì)量分數(shù)≥0.7%，知母皂苷BⅡ質(zhì)量分數(shù)≥3.0%。但不同等級種苗種植后，對藥材質(zhì)量的影響差異無統(tǒng)計學意義。這與于福來的研究結(jié)果，即不同等級種苗種植后收獲的藥材藥用成分含量間存在統(tǒng)計學意義上的差異有所不同。分析原因，可能與種植材料、栽培管理或種植環(huán)境不同所致，有待進一步的實驗驗證。

總之，本研究采用生產(chǎn)上常用的1年育苗2年移栽的栽培方式，研究不同等級種苗對比種植后對知母藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，結(jié)果表明種苗質(zhì)量分級對藥材產(chǎn)量有顯著影響，但對藥材質(zhì)量的影響差異無統(tǒng)計學意義。

2.5 種苗分級與植株生長、藥材產(chǎn)量及質(zhì)量的相關(guān)性分析

為進一步明確種苗分級對藥材產(chǎn)量及質(zhì)量的影響機制，對種苗等級與植株生長性狀、藥材產(chǎn)量及質(zhì)量指標的相關(guān)性進行分析，結(jié)果見表10。

知母種苗等級與植株存活率、種球直徑、單株根質(zhì)量、小區(qū)產(chǎn)量及芒果苷含量均呈負相關(guān)，但只有單株根質(zhì)量和小區(qū)產(chǎn)量與種苗等級的相關(guān)性達到顯著水平，說明種苗等級劃分主要通過單株根質(zhì)量來影響藥材產(chǎn)量。種苗等級與活性成分芒果苷含量與知母皂苷BⅡ的含量均沒達到顯著相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

優(yōu)質(zhì)種苗是提高中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的保證，進行知母種苗質(zhì)量分級可為規(guī)范知母種苗市場，提高種苗質(zhì)量和促進中藥材知母的規(guī)范化栽培生產(chǎn)提供參考依據(jù)[9-11]。為保護知母種苗生產(chǎn)、經(jīng)營和使用者的利益，建立更符合生產(chǎn)實際的知母種苗質(zhì)量標準，本研究通過對春季和雨季2個時期知母種苗基地與市場銷售種苗的質(zhì)量指標進行檢測，利用SPSS 20.0軟件通過相關(guān)分析和主成分分析，并結(jié)合生產(chǎn)實際，確定了種球直徑和百株質(zhì)量為知母種苗的質(zhì)量分級指標。利用K-均值聚類分析確定了知母種苗等級劃分的中心值，結(jié)合市場流通知母種苗的交易標準，及基地種植過程中知母種苗的使用情況，確定了知母種苗質(zhì)量等級的劃分標準，其中Ⅰ級種苗：種球直徑≥1.2 cm，百株質(zhì)量≤2.0 kg；Ⅱ級種苗：種球直徑≥0.8 cm，百株質(zhì)量≤1.5 kg；Ⅲ級種苗：種球直徑≥0.5 cm，百株質(zhì)量≤1.0 kg且≥0.5 kg，且不同等級種苗田間種植試驗驗證了知母種苗質(zhì)量等級劃分標準的可行性。種苗等級與植株生長性狀、藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的相關(guān)性分析表明，種苗等級可通過影響植株存活率和單株根鮮質(zhì)量來影響藥材的產(chǎn)量。由于植株生長、藥材產(chǎn)量和品質(zhì)受諸多因素影響，如種苗產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境及栽培措施等，本試驗是在相同栽培管理條件下，研究了種苗分級對植株生長性狀、藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，沒有涉及產(chǎn)地環(huán)境與栽培措施對植株生長、藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，環(huán)境及栽培措施能否彌補較低等級種苗質(zhì)量差帶來的不足還有待進一步研究。

表9 不同等級種苗種植對收獲藥材質(zhì)量的影響 %

表10 種苗等級與植株生長性狀、藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的相關(guān)性分析

注：*P<0.05。

藥材種植后能否獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)很大程度上取決于種苗的優(yōu)劣[12-15]。本標準與以往知母種苗質(zhì)量標準研究結(jié)果的不同之處，在于充分考慮了不同時期種苗質(zhì)量差異，以及市場銷售和種植生產(chǎn)中采用的標準，并利用各質(zhì)量指標之間的顯著相關(guān)性，簡化種苗標準的質(zhì)量指標，選擇種球直徑作為知母種苗質(zhì)量的決定性指標，并首次結(jié)合知母種苗市場流通和種植生產(chǎn)實際，引入了百株質(zhì)量作為主要參考指標，既保證了知母種苗質(zhì)量標準的科學性，又有可操作性，也更符合生產(chǎn)實際，對于知母藥材的規(guī)范化栽培生產(chǎn)具有現(xiàn)實可行的指導意義。