陳錦霞，史紫娟，陳偉鋼

國藥集團(tuán) 廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 順德 528303

天花粉為葫蘆科植物栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim.或雙邊栝樓T.rosthonii Harms.的干燥根[1]，為常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，性微寒，味甘、微苦。具有清熱瀉火，生津止渴，消腫排膿的作用，多用于熱病煩渴、肺熱燥咳、內(nèi)熱消渴、瘡瘍腫毒?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，天花粉主要具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒等作用，臨床常用于婦科引產(chǎn)、消渴證、艾滋病治療，外用治療紅腫熱痛等皮膚證[2-6]。天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑是由天花粉(栝樓)藥材經(jīng)炮制、提取、過濾、濃縮、干燥制備而成。

指紋圖譜技術(shù)作為一種綜合的、可量化的鑒定手段，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥材以及中藥制劑成品的質(zhì)量控制與評價。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)建立天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，為制定天花粉(栝樓)配方顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(沃特世公司)；MS105DU十萬分之一天平、AL104萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；MILLIPORE Synergy UV超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)；YMW機(jī)械分體煎藥壺(深圳一枚王有限公司)；TRL-0.5真空冷凍干燥機(jī)(大連雙瑞科技有限公司)；YRE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-DШ循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)水泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥

天花粉對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121361-201603)；檸檬酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111679-201602)；磷酸、甲酸、乙腈、甲醇為色譜純；乙醇為分析純；水為超純水；16批天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑(樣品編號為S1～S16)。

天花粉藥材經(jīng)國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司中級工程師鄧明生鑒定，除THF17批為天花粉(雙邊栝樓)外，其余批次均為天花粉(栝樓)。

1.3 藥材

參考2015年版《中華人民共和國藥典》天花粉項下炮制方法制成天花粉飲片[1]，藥材具體信息見表1。

表1 天花粉藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

以國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》為依據(jù)，制備天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑。取天花粉飲片100 g，置于砂鍋中，加水煎煮2次。第一次煎煮加9倍水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁熱過350目篩網(wǎng)濾過，濾液迅速冷卻，備用；二煎加飲片量7倍水，武火煮沸后，文火煎煮15 min，趁熱過350目篩網(wǎng)濾過，濾液迅速冷卻。合并2次濾液，65 ℃減壓濃縮，濃縮至約200 g，冷凍干燥，即得。天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑信息見表2。

表2 天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑批號

2.2 色譜條件

CORTECS T3色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)；以甲醇為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min，0%A；5～18 min，0%～45%A；18～20 min，45%～90%A；20～25 min，0%A)；流速為0.2 mL·min-1；檢測波長為220 nm；柱溫為30 ℃。

2.3 對照品溶液的制備

取天花粉對照藥材約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率：500 W，頻率：40 KHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得(臨用新制)。另取檸檬酸對照品適量，精密稱定，加水溶解，制成每1 mL含0.4 mg的溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水適量，超聲處理10 min(功率：500 W，頻率：40 kHz)，取出，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取同一批號(S6)天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按2.4項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2項下條件測定。以檸檬酸(峰1)為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(S6)，分別在0、4、6、8、10、12、16、20、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1 μL。以檸檬酸峰(峰1)為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批號樣品(S8)，分別精密稱取6份，按2.4項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件，分別進(jìn)樣1 μL，以檸檬酸峰(峰1)為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD均小于2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC指紋圖譜的建立

2.6.1 15批天花粉(栝樓)特征圖譜的測定 分別精密吸取2.4項下制備的各批次供試品溶液1 μL，注入液相色譜儀，按照2.2項下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果見圖1。

圖1 15批天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC疊加圖

2.6.2 天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜的建立 采用國家藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對15批天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC圖譜進(jìn)行處理，自動校正后進(jìn)行色譜峰匹配，匹配結(jié)果見圖2。以1號峰檸檬酸為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。見表3～4。15批天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照指紋圖譜相似度分別為0.923、0.988、0.971、0.996、0.993、0.975、0.988、0.997、0.998、0.985、0.993、0.961、0.989、0.990、0.979。

表3 15批天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜(相對保留時間)

2.7 天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑不同基原(栝樓和雙邊栝樓)指紋圖譜的區(qū)別

取天花粉(雙邊栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑S16，按2.4項下方法制備供試品溶液，按2.2項下條件測定，其指紋圖譜測定結(jié)果與天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比見圖3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

采用PAD檢測器對樣品進(jìn)行全波長掃描，通過對比不同檢測波長色譜圖發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測波長為220 nm時，天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜峰最多，且各色譜峰的響應(yīng)值均較高，因此選擇220 nm為檢測波長。另考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸4種流動相的分離效果，結(jié)果，在甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫下，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離度良好。

以峰1檸檬酸峰為參照峰，15批天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的其余3個特征峰相對保留時間RSD為0.18%～0.53%，均小于2.0%。

3.2 指紋圖譜的評價

本研究標(biāo)示了天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的4個共有峰，并通過相似度評價軟件計算出15批天花粉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對照圖譜的相似度，結(jié)果均大于0.90。各批次天花粉(栝樓)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的圖譜整體上基本一致，能夠全面提供質(zhì)量信息，本研究所建立的方法可為天花粉(栝樓)配方顆粒的質(zhì)量控制與評價提供參考。