雷慧霞， 于 營， 劉亞苓， 張新靜， 邢麗偉， 魯海坤， 吳健勇， 郭 靖

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所， 吉林 長春 130112)

白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz.)系蕓香科白鮮屬植物[1]，主產(chǎn)遼寧、河北、四川等地區(qū)，其根皮可以入藥，具清熱燥濕、祛風(fēng)解毒之功效[2]。白鮮的繁殖方式分為有性繁殖和無性繁殖，種子繁殖可快速擴(kuò)大栽培規(guī)模[3]。但其種子存在休眠特性，在種子育苗前必須先打破休眠[4]。黃衛(wèi)紅等發(fā)現(xiàn)，1～5 ℃沙藏處理白鮮種子可以促進(jìn)種子萌發(fā)[5]。韓月喬等研究發(fā)現(xiàn)，白鮮種子經(jīng)過50～100 mg·L-1GA3+低溫層積處理，12～14周后發(fā)芽率接近80%[6]。由此可見，白鮮種子發(fā)芽率低且發(fā)芽周期長，給種子檢驗(yàn)帶來了一定的困難。TTC染色法是快速、準(zhǔn)確測定種子生活力，判斷種子發(fā)芽潛力的一種有效方法[6]。彭國平等[7]用紅墨水染色法和TTC法分別測定了白鮮種子的生活力，測定結(jié)果僅為22.6%和23.3%。本實(shí)驗(yàn)分析了影響白鮮種子生活力測定的5個(gè)因素，以期篩選出TTC染色的最佳條件，以快速測定白鮮種子活力。

1 材料與方法

1.1 材 料

白鮮種子于2017年9月初購自遼寧省清原縣英額門鎮(zhèn)，種子千粒重10.90 g，種子含水量13.55%，保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 TTC染色法

1.2.1正交試驗(yàn)

本試驗(yàn)利用1份白鮮種子，采取L16(45)5因素4水平正交設(shè)計(jì)(見表1)，選擇影響染色效果的浸種溫度、浸種時(shí)間、TTC溶液濃度、染色溫度和染色時(shí)間5個(gè)因素為檢測指標(biāo)，每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平

水平試驗(yàn)因素A浸種溫度/℃B浸種時(shí)間/hCTTC濃度/%D染色溫度/℃E染色時(shí)間/h12560.1256230120.33012335180.53518440241.04024

1.2.2TTC溶液的配制

用pH=7.0的磷酸緩沖溶液和2,3,5-氯化三苯基四氮唑粉劑配制成1.0%、0.5%、0.3%和0.1%TTC溶液[6]。

1.2.3種子浸種處理

將白鮮種子去除種皮，分別放入加入等量蒸餾水的三角瓶中，并使種子完全浸沒，置于25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃恒溫箱內(nèi)，分別浸泡6 h、12 h、18 h和24 h。每個(gè)處理50粒種子，共設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4種子染色處理

種子浸泡后取出，用濾紙將種子表面的水分吸干，用鑷子去除胚乳和1片子葉，將留有種胚的那片子葉置于培養(yǎng)皿中[6]。將等量的1.0%、0.5%、0.3%和0.1%的TTC溶液加入培養(yǎng)皿中，至種子完全浸沒，分別置于25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃的恒溫箱內(nèi)避光染色6 h、12 h、18 h和24 h后取出，用蒸餾水沖洗3次。觀察染色結(jié)果，凡胚被染為紅色的種子就是有生活力的種子。

表2 TTC法測定種子生活力的正交試驗(yàn)結(jié)果

處理組合因素A因素B因素C因素D因素E平均生活力1A1(25)B1(6)C1(0.1)D1(25)E1(6)67.33±2.49ef2A1(25)B2(12)C2(0.3)D2(30)E2(12)77.33±0.94cd3A1(25)B3(18)C3(0.5)D3(35)E3(18)73.33±3.39de4A1(25)B4(24)C4(1)D4(40)E4(24)60.00±2.82gh5A2(30)B1(6)C2(0.3)D3(35)E4(24)91.33±0.94 a6A2(30)B2(12)C1(0.1)D4(40)E3(18)88.00±1.63ab7A2(30)B3(18)C4(1)D1(25)E2(12)64.00±1.63fg8A2(30)B4(24)C3(0.5)D2(30)E1(6)82.66±3.77bc9A3(35)B1(6)C3(0.5)D4(40)E2(12)76.66±3.77d10A3(35)B2(12)C4(1)D3(35)E1(6)70.00±2.82ef11A3(35)B3(18)C1(0.1)D2(30)E4(24)56.66±0.94h12A3(35)B4(24)C2(0.3)D1(25)E3(18)72.00±2.82de13A4(40)B1(6)C4(1)D2(30)E3(18)58.66±2.49gh14A4(40)B2(12)C3(0.5)D1(25)E4(24)34.66±3.39i15A4(40)B3(18)C2(0.3)D4(40)E1(6)68.00±3.26ef16A4(40)B4(24)C1(0.1)D3(35)E2(12)28.00±3.26jⅠj278.00 294.00 240.00 238.00 288.00Ⅱj326.00 270.00 308.67 275.33 246.00Ⅲj275.33 262.00 267.33 262.67 292.00Ⅳj189.33 242.67 252.67 292.67 242.67Rj136.67 51.33 68.67 54.67 49.33

注：表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同列不同小寫字母表示p<0.01水平差異顯著性。

1.3 種子發(fā)芽率測定

將白鮮種子用100 mg·L-1GA3溶液避光浸泡24 h，然后用1% NaClO浸泡消毒20 min[4]。將經(jīng)過消毒的濕沙與種子以3∶1的體積比混勻，放入帶蓋塑料盒內(nèi)，置于4 ℃冰箱中低溫層積。種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根突破種皮2 mm以上，種子發(fā)芽前每10 d檢查1次，開始發(fā)芽后每5 d統(tǒng)計(jì)1次發(fā)芽數(shù)，連續(xù)10 d沒有種子發(fā)芽視為發(fā)芽結(jié)束[8]。每個(gè)重復(fù)50粒種子，共設(shè)4次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)，篩選TTC染色法測定白鮮種子生活力的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽率測定結(jié)果

白鮮種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)目，分別為46、44、43、45粒，得出白鮮種子的平均發(fā)芽率為89.00%。

2.2 種子生活力測定結(jié)果

白鮮種子生活力測定結(jié)果見表2。白鮮種子生活力最高值為91.33%，對應(yīng)的組合為處理組合5，即30 ℃條件下浸種6 h、0.3%TTC濃度35 ℃條件下避光染色24 h，該組合的種子大部分被染成均勻的鮮紅色，染色效果較好(見圖1)。種子生活力測定的最低值為28.00%，對應(yīng)的組合為處理組合16，即40 ℃條件下浸種24 h、0.1% TTC濃度35 ℃條件下避光染色12 h，該組合大部分種子被染成淡粉色或未染色，染色效果較差(見圖2)。

2.3 極差分析

數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析(見表2)，比較5個(gè)因素對白鮮種子生活力測定值的影響，極差值R1=136.67，R2=51.33，R3=68.67，R4=54.67，R5=49.33，即浸種溫度對白鮮種子生活力測定值影響最大，其次是TTC濃度，而浸種時(shí)間、浸種溫度和染色溫度對測定值的影響均較小。

圖1 白鮮種子30 ℃浸種6 h、0.3% TTC濃度35 ℃避光染色24 h后染色效果

對Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj、Ⅳj進(jìn)一步分析，選取各個(gè)因素對應(yīng)的最大值來代表適合白鮮種子生活力測定條件。浸種溫度(因素A)中最大值為Ⅱ1=326.00，即浸種溫度可以選30 ℃；浸種時(shí)間(因素B)中最大值為Ⅰ2=294.00，即浸種時(shí)間可以選6 h；TTC濃度(因素C)中最大值為Ⅱ3=308.67，即TTC濃度可以選0.3%；染色溫度(因素D)中最大值為Ⅳ4=292.67，即染色溫度可以選40 ℃；染色時(shí)間(因素E)中最大值為Ⅲ5=292.00，即染色時(shí)間可以選18 h。綜上可得出，A2B1C2D4E3為較優(yōu)組合，即白鮮種子在30 ℃條件下浸種6 h后，在40 ℃條件下用0.3% TTC溶液避光染色18 h。

圖2 白鮮種子40 ℃浸種24 h、0.1%TTC濃度35 ℃避光染色12 h后染色效果

2.4 方差分析

進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表3)表明，試驗(yàn)設(shè)定的5個(gè)因素都對試驗(yàn)結(jié)果具有極顯著影響(p<0.01)，說明浸種溫度、浸種時(shí)間、TTC 濃度、染色溫度和染色時(shí)間都是影響白鮮種子生活力測定的主要因素。

表3 方差分析結(jié)果

方差來源自由度平方和均方F值顯著性浸種溫度(A)37277.58 2425.86 207.44 **浸種時(shí)間(B)31016.25 338.75 28.97 **TTC 濃度(C)32002.92 667.64 57.09 **染色溫度(D)31190.92 396.97 33.95 **染色時(shí)間(E)31574.25 524.75 44.87 **誤差30350.83 11.69

注：R2=0.97，“**”表示在0.01水平上具有極顯著差異。

3 結(jié)論與討論

3.1 TTC法測定白鮮種子生活力的最佳條件

本試驗(yàn)中，白鮮種子生活力達(dá)到91.33%的為處理組合5，該組合的種子大部分被染成均勻的鮮紅色，染色效果較好。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，30 ℃浸種6 h，40 ℃條件下0.3% TTC溶液避光染色18 h為較優(yōu)組合。將該組合與組合5相比較，除了染色溫度和染色時(shí)間不同，另外3個(gè)條件都相同，該組合的染色溫度為40 ℃，處理組合5的染色溫度為35 ℃，該組合的染色時(shí)間為24 h，處理組合5的染色時(shí)間為18 h。極差分析表明，染色溫度和染色時(shí)間對種子生活力測定值影響較小，處理組合5可以作為最優(yōu)組合。綜上所述，白鮮種子TTC染色的最佳條件為A2B1C2D3E4，即白鮮種子30 ℃浸種6 h后，35 ℃條件下0.3% TTC 溶液避光染色24 h。

3.2 TTC法測定白鮮種子生活力的可行性

TTC法測定的結(jié)果與發(fā)芽率一般很接近，而且種子生活力應(yīng)該大于或者等于發(fā)芽率[9-11]。本研究中測得白鮮種子發(fā)芽率為89.00%，種子生活力為91.33%，種子生活力略高于發(fā)芽率。TTC法測定白鮮種子的生活力所需的浸種時(shí)間與染色時(shí)間相加僅為30 h，而測定白鮮種子發(fā)芽率則需要12～14周[4]，因此在生產(chǎn)中可先用TTC法測定種子的生活力來判斷種子潛在的發(fā)芽能力并了解種子質(zhì)量。