李月　張志標(biāo)　周玉蓉　鐘進(jìn)良　劉蕊

摘 要：該文分析了柑橘黃龍病、裂皮病、衰退病及碎葉病的病原及其對(duì)柑橘生產(chǎn)的危害，并概述了柑橘脫毒技術(shù)的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：柑橘;病毒病;脫毒技術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào) S436.66文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）08-0080-03

Abstract：Pathogen characters and the harmfulness to citrus production of citrus virus and virus-like disease，including Citrus Huanglongbing，Citrus Exocortis Viroid ，Citrus Tristeza Virus and Citrus Tatter Leaf Virus，are described briefly. Recent progress on citrus virus-free? techniques are summarized.

Key words：Citrus;Virus diseases;Anti-virus technology

柑橘是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，近5年來(lái)我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)一直保持著穩(wěn)步發(fā)展的勢(shì)頭，種植面積與產(chǎn)量均穩(wěn)步增長(zhǎng)[1-2]。但隨著柑橘種植面積的不斷擴(kuò)大，病害問(wèn)題也接踵而至。柑橘極易感染一種或多種病毒類(lèi)病害，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育受阻、產(chǎn)量降低、果品品質(zhì)變劣，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致植株死亡[2-3]。柑橘病毒類(lèi)病害主要由病毒和類(lèi)似病毒引起，即由病毒、類(lèi)病毒、螺旋體和植原體等病原引起的[4]。目前，世界上已報(bào)道的柑橘病毒和類(lèi)似病毒病約有80余種，多具有易傳播、危害性大、多種病原復(fù)合侵染率高、感染后樹(shù)體終身帶毒和難以防治等特點(diǎn)[4-5]。我國(guó)較常見(jiàn)且對(duì)柑橘生產(chǎn)危害較大的病毒類(lèi)病害主要有柑橘黃龍病、裂皮病、衰退病和碎葉病等。這些病害均可通過(guò)苗木轉(zhuǎn)運(yùn)和芽條嫁接引種進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，同時(shí)還能在田間通過(guò)農(nóng)事操作和昆蟲(chóng)等進(jìn)行近距離擴(kuò)散。目前，針對(duì)柑橘病毒類(lèi)病害尚無(wú)有效的防治措施，只能通過(guò)嚴(yán)格檢疫、對(duì)本地良種進(jìn)行脫毒處理、建立無(wú)病毒苗木繁育和推廣體系、對(duì)已有疑似感染果樹(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)病株進(jìn)行鏟除等手段進(jìn)行防控。為此，本文就我國(guó)常見(jiàn)柑橘病毒類(lèi)病害的病原性質(zhì)、癥狀表現(xiàn)及脫毒技術(shù)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，以供參考。

1 我國(guó)柑橘主要病毒類(lèi)病害

1.1 柑橘黃龍?。–irtus Huanglongbing，HLB） 柑橘黃龍病病原最初被判斷為病毒[6-7]，之后廣西柑橘黃龍病研究小組通過(guò)四環(huán)素試驗(yàn)間接證明黃龍病病原不是病毒而是類(lèi)菌原體[8-9]。有研究者通過(guò)電鏡觀察以及青霉素試驗(yàn)認(rèn)為黃龍病病原為類(lèi)立克次氏體[10-12]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)對(duì)黃龍病病原的16S rDNA測(cè)序比對(duì)后證實(shí)黃龍病的病原菌是細(xì)菌[13-14]。柑橘黃龍病病原菌屬韌皮部桿菌屬（Candidatus Liberobacter），根據(jù)其16S rDNA的相似性可分為亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus）、非洲種（Candidatus Liberibacter africanus）和美洲種（Candidatus Liberibacter americanus）[14-16]。我國(guó)的柑橘黃龍病病原菌屬亞州種，其傳播方式主要為柑橘木虱傳播、嫁接傳播以及運(yùn)輸傳播。柑橘黃龍病在田間的癥狀十分復(fù)雜，常見(jiàn)癥狀為葉片斑駁黃化、新梢均勻黃化、缺素型黃化、紅鼻子果等，其中典型癥狀為葉片斑駁黃化。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)柑橘黃龍病的常用診斷方法為PCR檢測(cè)方法[17]。

1.2 柑橘裂皮病（Citrus Exocortis Viroid，CEVd） 柑橘裂皮病是由柑橘裂皮類(lèi)病毒引起的，屬馬鈴薯紡錘形塊莖類(lèi)病毒科馬鈴薯紡錘形類(lèi)塊莖病毒屬，分強(qiáng)毒株系和弱毒株系[18]。CEVd類(lèi)病毒為低分子量RNA，不編碼蛋白，RNA以線狀和共價(jià)閉合環(huán)狀2種分子形式共同存在于寄主體內(nèi)[19]。由于CEVd具有棍棒狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，鈍化溫度高，110℃下保持15min后仍具有侵染力，直至140℃其感染力才呈線性下降[20]。CEVd可感染多個(gè)柑橘種和品種，以枳殼及其雜種作砧木的柑橘易感，癥狀表現(xiàn)為砧木部分樹(shù)皮縱向開(kāi)裂、翹起、剝落、流膠，樹(shù)冠矮化，樹(shù)勢(shì)生長(zhǎng)變?nèi)酰Ｍㄟ^(guò)苗木的轉(zhuǎn)運(yùn)和嫁接進(jìn)行傳播。目前，我國(guó)建立了sPAGE、RT-PCR、斑點(diǎn)雜交、組織印跡雜交等一套完整的檢測(cè)體系，為CEVd的檢測(cè)和監(jiān)控提供參考依據(jù)[21]。

1.3 柑橘衰退病（Citrus Tristeza Virus，CTV） 柑橘衰退病由柑橘衰退病毒引起，屬長(zhǎng)線性病毒科（Closteroviridae）長(zhǎng)線性病毒屬（Closterovirus），其基因組由單鏈正義RNA （ssRNA）組成，含19296個(gè)核苷酸，是已知植物病毒中基因組最大的病毒，外殼蛋白分子量為25kDa[22，23]。衰退病毒根據(jù)其癥狀表現(xiàn)可分為以下3種類(lèi)型：速衰型（quick decline，QD），引起植株逐漸或快速的衰退或死亡;莖陷點(diǎn)型（stem pitting，SP），引起感染植株莖枝木質(zhì)部出現(xiàn)凹陷點(diǎn)或溝，同時(shí)導(dǎo)致樹(shù)體矮化、樹(shù)勢(shì)衰弱、生長(zhǎng)遲鈍等;苗黃型（seedling yellow，SY），引起植株葉片黃化。其中，速衰型和莖陷點(diǎn)型的株系為強(qiáng)毒系，苗黃型的株系為弱毒系，可用一些弱毒株系通過(guò)交叉保護(hù)的方式防治強(qiáng)毒株系的危害[24]。柑橘衰退病除通過(guò)嫁接傳播外，在田間還可通過(guò)橘蚜、棉蚜、橘聲蚜、桃蚜和繡線橘蚜傳播，其中橘蚜傳毒能力最強(qiáng)[25]。

1.4 柑橘碎葉病（Citrus Tatter Leaf Virus，CTLV） 柑橘碎葉病最初在北京檸檬和溫州蜜柑上被發(fā)現(xiàn)，主要通過(guò)汁液進(jìn)行傳播，嫁接工具是其主要傳播途徑，遠(yuǎn)距離傳播則是帶毒苗木和接穗，目前尚未發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)傳播[4]。CTLV屬發(fā)狀病毒科（Capilloviridea）發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）單鏈正義RNA（ssRNA）病毒，呈彎曲線狀顆粒，大小（600～700nm）×（13～15nm），基因組包含6496個(gè)核苷酸，蛋白外殼的分子量為27kDa。此外，具有3′端的poly（A）尾巴和2個(gè)開(kāi)放閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼242kDa前體蛋白和36kDa運(yùn)動(dòng)蛋白[26-27]。該病毒寄主范圍廣，能夠感染多個(gè)柑橘品種。我國(guó)枳殼砧的寬皮柑橘類(lèi)品種發(fā)病較重，常見(jiàn)癥狀為砧穗結(jié)合部位腫大并形成明顯的黃色環(huán)，植株葉片碎小缺損，樹(shù)勢(shì)衰弱甚至死亡。

2 柑橘病毒脫毒技術(shù)

2.1 熱處理及化學(xué)處理脫毒 熱處理脫毒法是最早和最普遍的果樹(shù)脫毒處理方法之一，其利用病毒不耐高溫的特點(diǎn)，通過(guò)加熱使植株中的病毒鈍化失活，從而起到脫除病毒的作用。由于不同種類(lèi)病毒的熱抗性不同，常使用35～40℃的溫度范圍進(jìn)行熱處理[28]。通常熱處理對(duì)線狀病毒、類(lèi)細(xì)菌、類(lèi)菌質(zhì)體等引起的病害有效，而對(duì)耐熱性高的類(lèi)病毒如裂皮病病毒等則沒(méi)有效果[29]。常用的熱處理方法有熱水處理法和濕熱空氣處理法。熱水處理法對(duì)休眠器官或離體接穗的效果較好，通常將待處理部分浸泡50℃左右的熱水中，一定時(shí)間后剝?nèi)∑湫菝哐窟M(jìn)行接種;濕熱空氣法則對(duì)生長(zhǎng)活躍的莖尖效果較好，通常是將待處理部分置于35～40℃下處理一定時(shí)間，可采用晝夜交替、低溫交替或隔日高溫的形式進(jìn)行[28，30]。對(duì)于不同病原菌及不同的植株，采用合適的處理時(shí)間與溫度是熱處理法成功的關(guān)鍵。化學(xué)處理脫毒多采用化學(xué)藥品進(jìn)行處理，如嘌呤嘧啶類(lèi)似物、抗生素、氨基酸等，其作用是抑制植株內(nèi)病毒的復(fù)制，目前柑橘上常用的是四環(huán)素[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)黃龍病病原的脫除，加熱與四環(huán)素相結(jié)合進(jìn)行處理，較單獨(dú)進(jìn)行熱處理或四環(huán)素處理的效果要好[12]。

2.2 莖尖培養(yǎng)脫毒 莖尖培養(yǎng)脫毒法的依據(jù)是：病毒通過(guò)植物維管束和胞間連絲進(jìn)行傳播，而植物分生區(qū)尤其是莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)（約0.1～0.5mm區(qū)域）無(wú)維管束，且細(xì)胞分裂增殖速度較病毒擴(kuò)散速度快，因此莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)含毒量極低，切取這類(lèi)微小的無(wú)病毒組織進(jìn)行培養(yǎng)即可獲得無(wú)病毒植株[4]。一般情況，切取的莖尖越小，脫毒效果越好，但隨著剝?nèi)〉慕M織越小，其成活率會(huì)降低，因此，對(duì)于不同的植株需要選擇合適的莖尖大小，以保證較好的脫毒效果和較高的成活率。

2.3 莖尖嫁接脫毒 由于莖尖培養(yǎng)脫毒法所取莖尖組織微小，不易培養(yǎng)，生根率和移栽成活率均較低，因而衍生出既能利用無(wú)毒莖尖組織嫁接，又能解決莖尖培養(yǎng)不易生根和成活的莖尖嫁接脫毒法。該方法于1972年由Murashige等[32]首先提出，1975年Navarro等[33]加以改進(jìn)，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外廣泛采用的脫毒方法。國(guó)內(nèi)研究也表明，莖尖嫁接可以脫除柑橘黃龍病、柑橘裂皮病等病原體[12，34-35]。影響莖尖嫁接成活的因素有：砧木品種、接穗選取、莖尖大小以及嫁接方法等[36]。由于莖尖嫁接仍然存在因莖尖較小而導(dǎo)致成活率較低，以及對(duì)部分病毒如碎葉病等的脫除無(wú)效，國(guó)內(nèi)外學(xué)者使之與熱處理相結(jié)合，在莖尖嫁接前通過(guò)一定時(shí)間和溫度的熱處理即可獲得滿(mǎn)意的脫毒效果，成功脫除出柑橘黃龍病、衰退病、裂皮病、碎葉病及鱗皮病等多種病毒類(lèi)病害[33，37]。

2.4 其他脫毒方法 除以上脫毒方法外，脫毒途徑還有珠心培養(yǎng)法、超低溫脫毒法、愈傷組織脫毒法等。其中，超低溫脫毒是目前研究的新方向，其原理是：在降低溫度的過(guò)程中，細(xì)胞因含水量較高，易形成較多冰晶，使得細(xì)胞破裂受損而亡，僅有生長(zhǎng)點(diǎn)的分生組織能夠存活下來(lái)，病原體失去寄主細(xì)胞而被脫除。目前，該技術(shù)在柑橘脫毒上的應(yīng)用仍較少，丁芳[38]研究發(fā)現(xiàn)，采用包埋玻璃化法對(duì)柑橘莖尖進(jìn)行超低溫處理，其黃龍病、衰退病以及裂皮病的脫毒率分別達(dá)91.6%、90.0%和88.8%。陳毅群等[39]采用超低溫處理與莖尖嫁接相結(jié)合對(duì)紅江橙、沙田柚、椪柑、北京檸檬和蘿崗甜橙等5個(gè)柑橘品種進(jìn)行黃龍病病原菌的脫毒處理，脫毒率達(dá)98.1%。

3 展望

建立柑橘無(wú)病毒苗木繁育體系是我國(guó)現(xiàn)代柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)，其中嫁接用莖尖接穗的脫毒處理是影響無(wú)病毒苗木成活率的重要因素。莖尖嫁接脫毒法是柑橘苗木中運(yùn)用最為廣泛的脫毒技術(shù)，但是單一的脫毒方法往往無(wú)法脫除多種病原菌，為獲得更好的脫毒效果，常采用物化處理與莖尖嫁接相結(jié)合的方式，如熱處理與莖尖嫁接相結(jié)合，化學(xué)藥物處理與莖尖嫁接相結(jié)合，以及近年來(lái)興起的超低溫處理與莖尖嫁接相結(jié)合?？共《巨D(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)基因工程技術(shù)在柑橘植株內(nèi)轉(zhuǎn)入外源抗病毒基因，促使植株可以在體內(nèi)表達(dá)對(duì)相應(yīng)病原菌的抗性，也為柑橘無(wú)病毒苗木的繁育提供了一條新的途徑。

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（責(zé)編：張宏民）