靳子康，房希碧，高 振，潘子意，劉 娟，姜 平，楊潤軍，趙志輝*

(1.廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江524088；2．吉林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春130062)

激素敏感型脂肪酶(HSL/LIPE)是一種會對激素產(chǎn)生敏感的脂肪酶，其主要在脂肪組織中表達(dá)，并且其活性受激素調(diào)控，所以被稱為激素敏感性脂肪酶。HSL基因與脂肪的分解與沉積密切相關(guān)，且被認(rèn)為是骨骼肌甘油三酯水解的主要酶[1]。在牛的基因組中，HSL位于第18號染色體上，含有14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子，但其在家鼠和人上擁有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。據(jù)報(bào)道，HSL在動物體內(nèi)出現(xiàn)了2種形式，一種是有活性的，另一種是無活性的。其中有活性的HSL能將TAG催化并水解為甘油二脂和游離脂肪酸[2]。并且通過研究表明HSL有兩種途徑可以被激活，一種是磷酸化的脂滴包被蛋白A(perilipin A)，這種包被蛋白能將其轉(zhuǎn)移到脂滴表面，使脂滴表面產(chǎn)生水解。另一種是被cAMP依賴蛋白激酶(PKA)激活，是唯一能夠通過磷酸化來控制其活性的酶，但后一種途徑不能使HSL完全激活，其途徑效率被檢驗(yàn)表明是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于脂滴包被蛋白A的調(diào)節(jié)途徑[2]。

HSL基因所編碼的激素敏感性脂肪酶有著多功能的水解作用，主要水解脂肪組織中的甘油三酯，另外還能將卵巢、腎上腺、睪丸和胎盤中的膽固醇酯水解，在機(jī)體能量供應(yīng)和類固醇生成作用中發(fā)揮重要作用[3]。其在脂肪組織中高表達(dá)，腎上腺、卵巢、睪丸、心臟、骨骼肌、巨噬細(xì)胞和胰島細(xì)胞表達(dá)量較低[4]。據(jù)報(bào)道，在小鼠的HSL基因中編碼有786個(gè)氨基酸，但沒有跨膜多肽，推測HSL是一種不附著在膜上的自由蛋白。還有稱在人類上，對體質(zhì)量較高男女的HSL基因中的SNP位點(diǎn)分析中，表明此基因與血漿內(nèi)的脂質(zhì)和葡萄糖的含量有相關(guān)性[5]。此外，HSL對肉品質(zhì)有的影響也有報(bào)道，并且通過對HSL的SNP位點(diǎn)相關(guān)性分析出，其與肉品質(zhì)性狀例如凈肉率，脂肪酸含量，調(diào)味百分比和pH值等有相關(guān)性[6-7]。以及有報(bào)道稱不飽和脂肪酸(SFAs)隨著時(shí)間和濃度的延伸，牛乳腺上皮細(xì)胞(MEC)的HSL的mRNA表達(dá)水平也會隨之上調(diào)[8]，表明脂肪酸的含量也可能會影響HSL基因的表達(dá)水平。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是通過用19～23 bp的小的雙鏈RNA與目的片段結(jié)合從而使mRNA產(chǎn)生降解，能夠有特異性地、高效地阻斷目的基因的表達(dá)，使被干擾的基因無法翻譯成蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生細(xì)胞或個(gè)體有特定基因缺失的表型，是一種典型的轉(zhuǎn)錄后對基因調(diào)控的方式，又被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。shRNA是一種長度為50～70個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA，具有特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：由5～10個(gè)核苷酸環(huán)與2條19～29個(gè)核苷酸的互補(bǔ)長鏈RNA片段連接，2條片段通過堿基互補(bǔ)配對成為雙鏈莖干[9]。載體啟動子的選擇對于shRNA的高表達(dá)有著至關(guān)重要的作用，通過酶切和連接載體把設(shè)計(jì)好的shRNA片段導(dǎo)入細(xì)胞或早期胚胎中，使shRNA上設(shè)計(jì)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)能在細(xì)胞內(nèi)被切割成小片段RNA，形成siRNA，隨著siRNA結(jié)合到RNA所誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物上(RISC)，此復(fù)合物能結(jié)合到目的基因的mRNA上，并通過片段的缺失導(dǎo)致mRNA的降解[10]。這種裝載了shRNA的載體可通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等途徑被傳遞到子代細(xì)胞中去，使得基因的沉默可遺傳，為研究特定基因的功能及調(diào)控方式創(chuàng)造了條件。目前，在人和小鼠等物種中存在大量關(guān)于HSL基因的研究，但對于牛HSL基因shRNA的靶序列篩選和載體構(gòu)建的研究尚無報(bào)道。因此，為進(jìn)一步探討和深入研究牛HSL基因功能，本試驗(yàn)以牛HSL基因?yàn)檠芯繉ο螅O(shè)計(jì)、構(gòu)建和篩選了基因的shRNA干擾載體，旨在為牛HSL基因系統(tǒng)和深入的研究提供有效工具和試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞系pGPU6-GFP-Neo載體由上海吉瑪公司購買，pBI-CMV3過表達(dá)載體(Clontech)，pMD18-T Simple vector(TaKaRa)，感受態(tài)細(xì)胞(Trans GenBiotech)，牛胎兒成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)，293T細(xì)胞系、pBI-CMV3-HSL過表達(dá)載體[11]由本試驗(yàn)保藏。

1.2 主要試劑質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根公司，Prime STAR HS DNA Polymerasa、DL2000 DNA Marker、SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)、T4DNA連接酶由TaKaRa公司提供，限制性內(nèi)切酶(NEB)，F(xiàn)ugene HD轉(zhuǎn)染試劑(Promega)，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清，DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基購自Hyclone公司，Trizol試劑是Invitrogen公司產(chǎn)品，蛋白裂解液(博士德)。

1.3 shRNA干擾載體設(shè)計(jì)和構(gòu)建牛HSL基因的CDS區(qū)序列從GenBank中獲得，通過shRNA靶序列設(shè)計(jì)網(wǎng)站Invitrogen，篩選了4條靶序列，加入9 nt的TTCAAGAGA序列形成了1種含莖環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且以6個(gè)T作為RNA polⅢ的轉(zhuǎn)錄終止子。分別命名為shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731、shRNA-HSL-1229、shRNA-HSL-2281，shRNA NC由上海吉瑪公司合成，靶序列和DNA Oligo序列詳情見表1。水浴退火，10 μL退火體系，正義鏈、反義鏈各1 μL，退火緩沖液(TE Buffer)1 μL，ddH2O 7 μL，混勻，放入95℃的水浴鍋，水浴5 min，關(guān)閉水浴鍋，待水溫降至室溫[12]。載體pGU6/GFP/Neo采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，50 μL體系，BamHⅠ，BbsⅠ 各1 μL，Cutsmart緩沖液5 μL，pGU6/GFP/Neo載體質(zhì)粒20 μL，ddH2O 23 μL，37℃孵育酶切2 h，得到含有黏性末端的載體，用T4DNA連接酶將線性化載體與退火得到的DNA雙鏈進(jìn)行連接，退火產(chǎn)物2 μL系，T4DNA Ligase Buffer 2 μL，pGU6/GFP/Neo 2 μg，T4DNA Ligase 1 μL，ddH2O 13 μL，共20 μL，充分混勻，置于16℃金屬浴中，過夜連接。連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑菌，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒。采用BamHⅠ酶切鑒定，確定載體片段大小正確后，送至北京金唯智生物公司進(jìn)行測序。對測序正確的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，-20℃保存，備用。

表1 HSL基因shRNA載體靶序列和退火DNA Oligo序列

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染分別將保存在液氮里的牛成纖維細(xì)胞和293T細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)，培養(yǎng)至匯合度為80%以上時(shí)對其進(jìn)行傳代，鋪六孔板，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。加入不含抗性的10%血清的培養(yǎng)基，之后以1∶2.5的比例加入質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑，即質(zhì)粒3 μg，F(xiàn)ugene轉(zhuǎn)染試劑7.5 μL。全部加入后室溫孵育15 min，隨后添加到六孔板中，輕微晃動鋪勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞總RNA提取及鑒定轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，采用Trizol方法提取細(xì)胞總RNA，將含有細(xì)胞的離心管中加入1 mL Trizol試劑，室溫裂解5 min。加入200 μL氯仿，顛倒混勻，室溫放置10 min，4℃、12 000×g離心15 min。將上清液移至新的無RNase的離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，室溫靜置10 min，4℃、12 000×g離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%的冷乙醇洗滌沉淀，混勻后4℃、7 500×g離心5 min棄上清。打開離心管蓋，室溫干燥RNA至半透明狀，加入20 μL DEPC水溶解。采用Nanodrop2000檢測RNA濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否有DNA和蛋白質(zhì)污染，是否降解。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將1 μg 的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄后剩余總RNA -80℃保存?zhèn)溆??！?/p>

1.6 熒光定量檢測轉(zhuǎn)染48 h后，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測目的基因mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)水平。熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq(2×)5.0 μL，PCR上游和下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，無核酸酶水3.6 μL，總反應(yīng)體積10.0 μL；反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；在定量擴(kuò)增參數(shù)后增設(shè)溶解曲線程序：95℃ 15 s，60℃ 20 s，95℃ 15 s。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參(上游5′-CATCGGCAATGAGCGGTTC-3′；下游5′-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3′)，通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測的HSL基因mRNA表達(dá)水平(上游5′-GATGAGAGGGTAATTGCCG-3′；下游5′- GGATGGCAGGTGTGAACT-3′)。

1.7 細(xì)胞蛋白提取及檢測轉(zhuǎn)染pBI-CMV3-HSL和shRNA載體的293T細(xì)胞48 h后，6孔板中每個(gè)孔細(xì)胞加入200 μL蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。BCA試劑盒檢測濃度后，調(diào)節(jié)上樣量每孔加入30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。分別以恒壓80 V 和100 V電泳至濃縮膠和分離膠底部，并以200 mA恒流、50 min轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。用5%的脫脂奶粉封閉2 h，按照1∶1 000濃度加入一抗HSL和Actin(內(nèi)參)，4℃放置搖床上過夜孵育抗體。按1∶2 000濃度加入二抗羊抗兔IGg，室溫?fù)u床上孵育抗體1 h。調(diào)配顯色劑使其顯色，儀器曝光并拍照，對比樣品和內(nèi)參的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 牛HSL基因shRNA載體的構(gòu)建shRNA載體BamHⅠ單酶切結(jié)果顯示，片段長度與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。通過Sanger測序進(jìn)一步表明，獲得的shRNA干擾載體的序列與設(shè)計(jì)的shRNA干擾載體一致(圖2)。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建牛HSL基因shRNA載體。

圖1 牛HSL基因shRNA載體酶切鑒定結(jié)果 M.Lambda DNA/Eco130I Marker;1，2.HSL-Bos-731 BamHⅠ酶切結(jié)果；3，4.HSL-Bos-1229 BamHⅠ酶切結(jié)果；5，6.HSL-Bos-2281 BamHⅠ酶切結(jié)果；7，8.HSL-Bos-625 BamHⅠ酶切結(jié)果

2.2 BFF細(xì)胞中HSL基因干擾載體的篩選通過轉(zhuǎn)染BFF細(xì)胞，在mRNA水平篩選具有較高干擾效率的干擾載體，顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h后，細(xì)胞形態(tài)正常，綠色熒光蛋白表達(dá)水平如圖3所示。熒光定量檢測結(jié)果表明，在mRNA水平，shRNA-HSL-625的干擾效率為14%、shRNA-HSL-731的干擾效率為83%、shRNA-HSL-1229的干擾效率為48%和shRNA-HSL-2281的干擾效率為41%，其中shRNA-HSL-1229和shRNA-HSL-2281組的細(xì)胞中HSL的mRNA表達(dá)水平與對照組shRNA-NC存在顯著差異(P<0.05)，shRNA-HSL-731與對照組shRNA-NC存在極顯著差異(P<0.01)，而shRNA-HSL-625與對照組shRNA-NC相比無顯著差異(P>0.05)，因此，在BFF細(xì)胞中，shRNA-HSL-731具有較高的干擾效率(圖4)。

圖2 牛HSL基因shRNA載體測序峰圖 A.HSL-Bos-731 shRNA載體；B.HSL-Bos-1229 shRNA載體；C.HSL-Bos-2281 shRNA載體；D.HSL-Bos-625 shRNA載體

圖3 牛HSL基因shRNA載體轉(zhuǎn)染BFF細(xì)胞 A～E.白光下細(xì)胞形態(tài)；a～e.激發(fā)光下綠色熒光蛋白

2.3HSL基因shRNA干擾載體效率驗(yàn)證由于BFF細(xì)胞HSL基因表達(dá)水平較低，不能檢測到蛋白的表達(dá)水平，因此，采用過表達(dá)載體與干擾載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證shRNA干擾載體和過表達(dá)載體在蛋白水平上HSL的表達(dá)情況。293T共轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞形態(tài)良好，同時(shí)綠色熒光蛋白表達(dá)表明轉(zhuǎn)染效率較高，為70%～80%(圖5)。在mRNA水平shRNA-HSL-625的干擾效率為83%、shRNA-HSL-731的干擾效率為82%、shRNA-HSL-1229的干擾效率為78%和shRNA-HSL-2281的干擾效率為14%，其中shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731和shRNA-HSL-1229與對照組shRNA-NC存在極顯著差異(P<0.01)，而shRNA-HSL-2281與對照組shRNA-NC相比無顯著差異(P>0.05)，shRNA-HSL-731和shRNA-HSL-625具有較高的干擾效率(圖6)。

圖4 BFF細(xì)胞中HSL基因mRNA表達(dá)水平 1.*表示顯著性差異(P<0.05)；2.**表示極顯著性差異(P<0.01)。下同

在293T細(xì)胞中，對空白組和共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中HSL基因蛋白水平質(zhì)含量檢測結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染HSL過表達(dá)載體的293T細(xì)胞中牛HSL不表達(dá)，而過表達(dá)pBI-CMV3-HSL載體后，細(xì)胞中能夠檢測到HSL蛋白。在共轉(zhuǎn)染干擾載體后，shRNA-HSL-2281的干擾效率最低，shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731和shRNA-HSL-1229共轉(zhuǎn)染組中的HSL蛋白均未檢測到，表明干擾效率較高，與mRNA表達(dá)水平一致(圖7)。

圖6 293T細(xì)胞中牛HSL基因mRNA表達(dá)水平 ***代表極顯著差異,P<0.001

3 討論

脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)。其中，HSL就是一種激素敏感型脂肪酶，其活力受激素調(diào)控，在脂肪中高表達(dá)且主要由脂肪組織進(jìn)行分泌，同時(shí)也在胰腺、睪丸、肌肉、腎上腺等組織發(fā)現(xiàn)其表達(dá)[4]。HSL作為一種細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪酶，能水解甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和膽甾烯基酯，沒有水解磷脂酶活性。HSL基因敲除后導(dǎo)致脂肪水解能力被破壞，脂質(zhì)合成和脂肪代謝能力明顯下降，這說明了HSL在脂肪的合成及分解代謝中起著關(guān)鍵作用。機(jī)體運(yùn)動起始時(shí)，HSL活化參與脂肪水解，這同時(shí)也是運(yùn)動引起脂肪水解增加的主要原因。

圖7 293T細(xì)胞中HSL基因蛋白表達(dá)水平(上為柱狀圖，下為印跡圖) 1.未轉(zhuǎn)染;2.shRNA NC;3.shRNA HSL-2281;4.shRNA HSL-1229;5.shRNA HSL-731;6.shRNA HSL-625

利用shRNA 表達(dá)載體進(jìn)行RNAi技術(shù)在多種動物體內(nèi)取得成功(如小鼠、大鼠)，利用shRNA干擾技術(shù)建立小鼠模型已有大量的報(bào)道，并且通過構(gòu)建shRNA干擾載體驗(yàn)證多種基因?qū)ε?、羊早期胚胎、乳脂、肉質(zhì)等有經(jīng)濟(jì)效益性狀的影響，其中對牛早期胚胎發(fā)育的囊胚階段發(fā)現(xiàn)有一定的影響[13]，臨床上對牛病毒性腹瀉也有相關(guān)的研究[14]。因shRNA能夠特異的干擾目的基因的表達(dá)，并能持久穩(wěn)定的作用于靶基因，使得該技術(shù)成為目前基因功能研究和生物治療等領(lǐng)域的重要技術(shù)，有報(bào)道稱shRNA干擾已經(jīng)應(yīng)用于家族性結(jié)腸息肉的臨床治療以及其他癌癥的相關(guān)治療，對改善胰島素抵抗和脂肪肝也有最新的進(jìn)展[15]。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731、shRNA-HSL-1229、shRNA-HSL-2281等4個(gè)干擾載體，轉(zhuǎn)染BFF細(xì)胞初步檢測了細(xì)胞中各載體在mRNA水平的干擾效率。但是,HSL基因在BFF細(xì)胞中表達(dá)量很低，通過Western blot未能檢測到蛋白質(zhì)含量。為進(jìn)一步檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的干擾效率，采用具有更高的轉(zhuǎn)染效率且不表達(dá)牛HSL的293T細(xì)胞，通過過表達(dá)載體和shRNA載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，進(jìn)一步在mRNA和蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了shRNA載體的干擾效率，結(jié)果顯示shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731、shRNA-HSL-1229等3個(gè)干擾載體在mRNA水平和蛋白水平均顯示干擾效率十分顯著。因此，結(jié)合BFF細(xì)胞檢測結(jié)果，最終確定shRNA-HSL-731作為干擾效率較高且比較穩(wěn)定的載體用于今后的試驗(yàn)和研究更為合理。本試驗(yàn)研究結(jié)果為進(jìn)一步研究HSL基因功能提供了有效工具，為牛脂肪代謝和HSL基因的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。