周帥帥，關繼羽，張 競，周艷龍，劉 芳，高 宇，趙 魁，高 豐，賀文琦

(吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062)

羊傳染性膿皰病在我國西北、東北等廣大養(yǎng)羊地區(qū)廣泛存在，對我國養(yǎng)羊產業(yè)造成巨大損失，該病俗稱“羊口瘡”，是由痘病毒科副痘病毒屬的羊傳染性膿皰病毒(Orf virus ORFV)所引起的一種急性、高度接觸性的人獸共患傳染病。ORFV有較強的嗜上皮性，在病毒感染早期主要是在被感染病畜的口鼻部、外陰部以及母畜的乳房等一些重要部位出現明顯的紅疹、丘疹、水泡等臨床體征和癥狀，隨著病情的進一步發(fā)展加劇會逐漸的形成較大的膿皰甚至會生成厚厚的結痂。羊傳染性膿皰病雖然在成年羊群中造成的病死率較低，但在羔羊中的病死率很高，因為羔羊在吃乳的過程中通過母體而被感染，其主要感染是在口腔及唇舌等部位。由于口腔等處生成了水泡或膿皰造成了羔羊的采食障礙，所以對羔羊的生長性能帶來了嚴重影響，有時也會引起繼發(fā)性細菌感染會使病情進一步惡化，導致羔羊的死亡[1]。

不同ORFV分離毒株基因組長度為136～138 kb 不等，約編碼132個基因。ORFV基因組的中間區(qū)域基因較為保守，多與病毒粒子結構和病毒組裝有關。兩末端為反向重復序列，基因結構變異較大，多與病毒的毒力、致病性以及免疫調節(jié)功能密切相關。病毒的整個基因組呈現環(huán)狀并在交匯處存在發(fā)卡結構，在掃描電鏡下可見病毒粒子為橢圓形并在其自身表面存在相互交錯的網狀結構[2-4]。該病毒在宿主細胞的細胞質中完成自身的復制過程，并在高爾基體上形成囊膜，最后通過使宿主細胞的破裂得以重新釋放。

研究人員已經闡明了一些ORFV的毒力基因的致病機制[5-6]。如ORFV132基因所編碼合成的血管內皮生長因子，該因子作用于宿主機體時可促進內皮細胞的快速增殖，這就為病毒復制提供細胞底物[7]。ORFV125基因是抗凋亡基因，該基因編碼生成的蛋白與Bcl-2家族中的Bak有著相似的表面結構可以競爭性抑制凋亡的激活，所以該基因的表達可以防止病毒感染細胞的凋亡。ORFV117基因編碼的粒細胞-巨噬細胞集結刺激因子抑制因子可以和IL-2結合并抑制其生物活性進而減弱機體的免疫應答，減緩機體對病毒的殺滅作用。ORFV112基因是一種毒力基因，在毒性和發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用，ORFV將CBP分泌到皮膚上皮細胞中,競爭性地抑制趨化因子與同源受體的相互作用,從而抑制趨化性和白細胞募集[8]。還有ORFV002,ORFV024和ORFV121基因所編碼合成的產物是 NF-kB信號通路的抑制劑，抑制宿主細胞中NF-KB信號傳導途徑的不同過程，有助于ORFV逃避宿主細胞的免疫反應[9-13]。雖然通過前人的研究已經對ORFV一些基因功能有所了解，但是依然還有許多基因的功能有待于我們去發(fā)掘。如位于末端可變區(qū)的ORFV122基因就是功能未知基因。為了對ORFV122基因的功能做進一步的研究就要做好前期的物質準備。所以在本研究中，我們純化得到了ORFV122蛋白并免疫小鼠得到了多克隆抗體，為后續(xù)的ORFV122基因研究做好物質準備。

1 材料與方法

1.1 病毒和質粒羊傳染性膿皰病病毒ORFV-SY17、原核表達載體PET-28a均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器DL2000 DNA Marker、Primerstar Max、T4DNA連接、青霉素、鏈霉素、胎牛血清購自以色列Biological Industrues公司；鎳離子親和層析柱購自美國ThermoFisher生物公司；瓊脂糖核酸膠回收試劑盒、大腸桿菌質粒提取試劑盒購自大連寶生物科技有限公司；異丙基2-β2-D硫代半乳糖苷(IPTG)、考馬斯亮藍等均購自上海生工生物工程有限公司；蛋白濃縮柱購自美國密理博公司；轉染試劑Lipofectamine3000購自美國sigma公司；病毒DNA提取試劑盒購自德國analytik jena生物科技公司。

1.3 目的蛋白結構分析使用蛋白生物學分析軟件DNAstar對ORFV122蛋白的基本生物信息進行分析，對ORFV122蛋白的抗原位點、親水區(qū)、疏水區(qū)等信息進行預測[14]。通過Phyre2數據庫對ORFV122蛋 白進行三級結構進行比對分析。

1.4 引物的設計與合成在基因數據庫中找到目的基因序列,利用Primer Premire 5.0軟件設計1對引物,ORFV122-F 5′-CCGGAATTCATGGCG-AACAGGCTCGTGTT-3′；ORFV122-R 5′-CCCA-AGCTTCTAACCGTCGATCTCCATGG-3′;擴增片段大小為972 bp。

1.5 ORFV122基因的擴增以提取的ORFV基因為模版，PCR擴增ORFV122基因。按實驗室常規(guī)的25 μL體系與條件進行操作，設置6個重復。

1.6 重組表達質粒的構建使用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切PCR擴增出的ORFV122基因片段與PET-28a載體，并把酶切產物用T4連接酶進行連接。把連接產物轉化到大腸桿菌BL21(DE3)表達感受態(tài)中，37℃培養(yǎng)1 h后把菌液均勻的涂在卡那板上。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜并挑取若干單個菌落擴大培養(yǎng)，并把菌液進行測序，把測序成功的菌液做保菌處理并放入-80℃冰箱保存。

1.7 目的蛋白的誘導表達在菌液測序成功后接種于800 mL含有100 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中。37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時，加入IPTG誘導表達，收集菌液，并進行SDS-PAGE用于鑒定是否有目的蛋白的表達。

1.8 目的蛋白誘導表達條件的優(yōu)化

1.8.1誘導時間的優(yōu)化 將6支裝有相同菌液的試管37℃、180 r/min搖床震蕩培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時，加入終濃度1 mmol/L IPTG分別誘導2，4，6，8，10，12 h。從每支試管中取等量的菌液制備SDS-PAGE樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析最佳誘導時間。

1.8.2誘導溫度的優(yōu)化 將6支裝有相同菌液的試管搖床震蕩培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時，加入終濃度1 mmol/L的IPTG分別在16，18，20，25，30，37℃下誘導8 h。從每支試管中取等量的菌液進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析最佳誘導溫度。

1.8.3IPTG誘導濃度的優(yōu)化 將7支裝有相同菌液的試管搖床震蕩培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時，加入終濃度分別0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2,1.5 mmol/L的IPTG 37℃搖床誘導8 h。從每支試管中取等量的菌液制備SDS-PAGE樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析最佳誘導劑濃度。

1.9 目的蛋白的表達、純化和濃縮將800 mL表達目的蛋白的菌液37℃搖床培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導表達8 h，待誘導時間結束后以6 000 r/min離心15 min收集菌體沉淀物。棄去上清，用PBS溶液重懸后超聲裂解菌體，4℃、12 000 r/min離心10 min并收集上清，使用Ni+-IDA金屬螯合蛋白質純化柱純化目的蛋白。按照其說明書進行純化，收集洗脫液。并將收集的洗脫液置于蛋白濃縮柱進行濃縮，蛋白濃縮后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 目的蛋白免疫小鼠在一免時取等量的目的蛋白與弗氏完全佐劑混合然后置于震蕩器上在四度的環(huán)境中震蕩過夜，待其完全乳化后使用注射器吸取0.2 mL并在小鼠皮下多點注射。在第二免、三免以及四免過程中乳化劑使用的是弗氏不完全佐劑其余步驟與一免一致。

1.11 Western blot法檢測抗體的特異性將目的蛋白制樣后通過SDS-PAGE電泳之后再轉移到固相載體PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中37℃封閉。1 h 后將PVDF膜重新置于由PBST稀釋的免疫血清中(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜。PBST洗3～5次，每次5～8 min。加入經PBST稀釋的羊抗鼠IgG-HRP二抗(1∶10 000稀釋)37℃孵育1 h后，PBST洗膜3次，每次5～10 min，然后用DAB顯色分析。

2 結果

2.1 目的蛋白抗原預測結果根據軟件DNAstar對目的蛋白二級結構、B細胞抗原表位、親水性等參數的分析見圖1，根據蛋白數據庫信息比對可知目的蛋白三級結構見圖2。通過以上分析目的蛋白有較好的親水性，而且抗原指數得分也較高，故推測該目的蛋白作為抗原會產生較好的免疫應答。

圖1 目的蛋白二級結構、B細胞抗原表位、親水性等參數的分析結果(由上到下不同的區(qū)域依次代表了目的蛋白疏水區(qū)和親水區(qū)、目的蛋白α螺旋、目的蛋白β折疊、 抗原性指數、目的蛋白表面可及性)

圖2 目的蛋白三級結構建模

2.2 ORFV122基因PCR擴增提取ORFV的基因組，并將其作為模版，PCR擴增ORFV122基因。PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預期片段大小(972 bp)基本一致(圖3)。

圖3 PCR擴增ORFV122基因電泳圖 M.DL2000 DNA Marker；1.ORFV122基因的擴增產物

2.3 重組表達質粒的構建及鑒定對固體培養(yǎng)基上挑取的10個陽性克隆進行菌液PCR鑒定(圖4)以便排除假陽性。將可以擴增出目的基因的菌液送至公司進行測序，將測序結果與ORFV122基因進行比對，將比對一致的克隆進行質粒提取。

圖4 重組質粒為模版PCR擴增ORFV122基因電泳圖 M.DL2000 DNA Marker；1～10.挑取的10個陽性克隆的菌液PCR結果

2.4 目的蛋白誘導條件的優(yōu)化

2.4.1目的蛋白誘導時間的優(yōu)化 完成誘導后分別在不同試管中取相同菌液制備SDS-PAGE樣品進行蛋白質凝膠電泳，檢測結果是誘導8 h時蛋白的表達最優(yōu)(圖5)。

圖5 目的蛋白在不同的誘導時間時考馬斯亮藍染色結果 M.蛋白質Marker；1～6.分別是在誘導2，4，6，8，10，12 h時考馬斯亮藍染色情況

2.4.2目的蛋白誘導溫度的優(yōu)化 分別在16，18，20，25，30，37℃下誘導6 h的試管中取等量的菌液，用菌液制備SDS-PAGE樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析最佳誘導溫度是30℃(圖6)。

圖6 目的蛋白在不同的誘導溫度時考馬斯亮藍染色情況 M.蛋白質Marker；1～6.分別是在16，18，20，25，30，37℃時考馬斯亮藍染色情況

2.4.3誘導劑IPTG誘導濃度的優(yōu)化 分別在相應的試管中取相同菌液制備SDS-PAGE樣品。經過SDS-PAGE檢測發(fā)現當IPTG終濃度為1.0 mmol/L時誘導效果最好(圖7)。

2.5 目的蛋白的純化和濃縮在誘導結束后經過離心、超聲、鎳柱結合以及不同濃度咪唑溶液洗脫等過程純化目的蛋白，結果顯示在37 000處出現了目的條帶(圖8)，并把所得到的蛋白經蛋白濃縮柱濃縮，得到了純度和濃度較高的重組蛋白,SDS-PAGE結果見圖9。

圖7 目的蛋白在不同的誘導濃度下考馬斯亮藍染色結果 M.蛋白質Marker；1～7.分別是在誘導劑濃度在0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mmol/L時考馬斯亮藍染色結果

圖8 目的蛋白在不同的濃度的咪唑洗脫時考馬斯亮藍染色結果 M.蛋白質Marker；1～6.分別是濃度為40，60，80，120，160，200 mmol/L咪唑洗脫結果

圖9 目的蛋白在純化濃縮后SDS-PAGE結果 M.蛋白質Marker；1.純化濃縮后的目的蛋白

2.6 抗體血清的采集在四免之后5～7 d對小鼠進行眼球采血并把血液放置4℃環(huán)境2～4 h，使其自動凝集析出血清，3 000 r/min離心10 min。并用注射器吸取上清注入新的離心管中，并放入-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 抗體效價以及特異性的檢測對多克隆抗體效價的檢測我們采用間接ELISA的方法，通過目的蛋白包被、封閉、孵育一抗、二抗再加終止液終止反映，最后在酶標儀下測定450 nm處的吸光值。對數據進行處理得到多抗的效價約為1∶80 000。用ORFV野毒型感染OFTU細胞，在感染48 h后收集細胞裂解液制成SDS-PAGE樣品，進行Western blot檢測多抗的特異性，結果顯示在相應的位置出現了特異性條帶(圖10)。此外，使用該抗體對ORFV122蛋白的表達規(guī)律進行了研究(圖11)，發(fā)現ORFV122蛋白為早期表達蛋白，隨著時間的推移表達量逐漸增加。

圖10 多抗特異性檢測結果 M.蛋白質Marker；1.內參β-actin；2.ORFV122蛋白

圖11 不同感染病毒時間ORFV122蛋白表達量的變化情況

3 討論

在對ORFV122蛋白進行生物學同源性分析時發(fā)現該蛋白和VACV的A51R基因所編碼的蛋白有較高的同源性。通過查閱文獻可知A51R基因除了為毒力基因外其編碼的蛋白還和宿主細胞的微管細胞骨架相互作用，保護宿主微管細胞骨架不發(fā)生解聚，并且與宿主細胞骨架相互作用的能力是A51R的保守特性。ORFV122和VACV A51R有著較高的同源性，根據對A51R的研究來對ORFV122的功能做出假設，這就進一步為ORFV122蛋白進一步研究指明方向。

通常羊傳染性膿皰病是根據病理檢查和臨床體征進行診斷的，但在疾病早期，由于該病和羊痘、小反芻獸疫以及口蹄疫的臨床癥狀較為相似，所以想要準確的辨別該病十分困難。特異性抗體無論在臨床診斷還是實驗室研究中都有廣泛的應用。制備的多克隆抗體可用于ELISA、Western blot和免疫組織學等檢測方法的診斷和流行病學研究，還可以通過免疫沉淀，免疫熒光，免疫金測定和免疫組織化學檢測病毒的進入和定位來研究致病機制，并開發(fā)可能的亞單位疫苗和治療藥物。

本試驗結果表明，成功的制備ORFV122蛋白的多克隆抗體，通過檢測多抗的效果良好。ORFV122蛋白多抗的制備為該疾病的診斷和進一步的研究奠定了基礎，也為ORFV122基因的生物學特性研究提供物質基礎。