朱永闌，張春燕，程昱璇，崔佳奕，蔣 濤，檀旭東，桑培培，舒 楊，史文杰，張民杰，田亞平

(中國人民解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室，北京 100853)

甲基丙二酸血癥是先天性有機酸代謝缺陷病中最常見的病種，其發(fā)病率較高，危害較大，于1967年首次被報道[1]。該病由甲基丙二酸輔酶A變位酶缺陷或其輔酶鈷胺素代謝異常導(dǎo)致甲基丙二酸、甲基枸櫞酸、丙酸等代謝物蓄積，進一步造成腎臟、神經(jīng)、肝臟等多臟器損害[2]。此病多從新生兒或嬰兒期開始出現(xiàn)癥狀,致死率高，臨床表現(xiàn)存在個體差異，極易漏診、誤診[3]，因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療非常重要。目前，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因其簡便廉價、高通量的特點已廣泛應(yīng)用于新生兒遺傳代謝的篩查[4]。本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查2015年10月至2017年12月在中國人民解放軍總醫(yī)院進行新生兒篩查的樣本，現(xiàn)對這部分樣本應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜篩查甲基丙二酸血癥，結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2015年12月至2017年12月在中國人民解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室進行新生兒48項遺傳代謝病篩查樣本近10萬例，樣本來自四川、貴州、湖北、西藏、新疆、北京，所有參與篩查者家長均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1液相串聯(lián)質(zhì)譜分析 參照文獻[5],利用非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜試劑盒(美國 PerkinElmer公司)完成樣本上機前處理。利用Waters TQ Dectctor串聯(lián)質(zhì)譜儀對樣品進行檢測，用 Masslynx.V4.0軟件(美國 Waters 公司)處理數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)上傳至新生兒疾病篩查系統(tǒng)(杭州博圣公司定制)，通過檢查和審核生成報告。其中樣本的置信區(qū)間是以人群指標(biāo)濃度分布的0.5%～99.5%作為臨床判讀截斷范圍。

1.2.2氣相色譜質(zhì)譜分析 參照文獻[6]中的方法對尿液樣本進行處理和檢測。所用儀器為Thermo fisher公司的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(TSQ 8000 Evo)。

1.2.3基因突變分析 本文篩查樣本采用全外顯子測序技術(shù)進行基因突變分析。流程：核酸提取-超聲打斷-文庫構(gòu)建(TruSeq DNA Sample Preparation 試劑盒)-捕獲全外顯子區(qū)域(Roche NimblegenSeqCap EZ v5.1試劑盒)-illumina平臺高通量測序-數(shù)據(jù)分析(CNV/SV 數(shù)據(jù)經(jīng)in house cohort、1000 Genomes及公開CNV 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)過濾攜帶率，使用Langya注釋)。

2 結(jié) 果

2.1疑似陽性樣本信息 近10萬份篩查樣本中甲基丙二酸血癥、丙酸血癥疑似陽性樣本信息見表1。本實驗室丙酰基肉堿(C3)參考范圍為0.30～4.00 μmol/L，丙?；鈮A/乙酰基肉堿(C3/C2)參考范圍為0.03～0.24 μmol/L。共召回132例疑似甲基丙二酸血癥、丙酸血癥樣本，其中C3增高(4.52～10.72 μmol/L)62例(男36例，女26例)，C3/C2增高(0.28～0.44 μmol/L)10例(男8例，女2例)，C3增高(4.04～11.42 μmol/L)伴C3/C2增高(0.23～1.55 μmol/L)60例(男33例，女27例)。

表1 甲基丙二酸血癥、丙酸血癥疑似陽性患兒信息表(n=132)

2.2串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果分析 串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果顯示，確診的例1患兒C3=11.63 μmol/L和C3/C2=1.55 μmol/L比值顯著增高，符合甲基丙二酸血癥、甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥、丙酸血癥的代謝特點，需進一步結(jié)合尿氣相檢測和基因檢測進行確診。確診的例2患兒C3=5.94 μmol/L和C3/C2=0.75 μmol/L比值也增高，符合甲基丙二酸血癥、丙酸血癥的代謝特點，也需要結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和基因測序進行診斷。

2.3氣相色譜質(zhì)譜結(jié)果分析 尿液氣相色譜質(zhì)譜結(jié)果顯示，例1患兒甲基丙二酸(36.14 μmol/L)、甲基枸櫞酸(2.48 μmol/L)指標(biāo)升高，符合甲基丙二酸血癥代謝特征。由于例2在召回確診前已死亡，未成功召回進行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，無檢測結(jié)果。

2.4基因突變結(jié)果分析 基因突變結(jié)果分析顯示，例1患兒MMACHC基因存在c.609G>A和c.658～660del AAG位點雜合突變，且患兒血同型半胱氨酸增高(63 μmol/L,參考值5～20 μmol/L)，確診為cblC型合并同型胱氨酸血癥。例2患兒存在與丙酸血癥相關(guān)的PCCA(c.1676)和PCCB(c.835dupc)2個基因突變。見表2。

表2 2例患兒基因檢測結(jié)果

3 討 論

甲基丙二酸血癥是有機酸代謝缺陷病中發(fā)病率較高、危害較大的一類常染色體隱性遺傳病,在歐美國家的發(fā)病率為1/169 000～1/48 000[7-8],我國無確切的統(tǒng)計資料，相關(guān)報道顯示臺灣為1/85 000[9],浙江為1/64 708[10]，上海為1/26 000[11],山東為1/3 920[12],是有機酸血癥中最常見的一種類型。本實驗室新生兒篩查平臺上檢測了來自四川、貴州、湖北、西藏、新疆、北京6地近10萬例樣本。通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)共篩查出132例疑似陽性樣本，可疑陽性率約為1.32‰，進一步通過氣相色譜質(zhì)譜和基因測序分析，確診甲基丙二酸血癥1例，發(fā)病率約為1/100 000。可疑陽性率遠(yuǎn)高于發(fā)病率，國內(nèi)外也存在這個篩查假陽性率較高的問題，如何在避免漏診的情況下使假陽性率減少，提高陽性預(yù)測值有待進一步研究。

甲基丙二酸血癥主要包括mut0、mut-、cblA、cblB構(gòu)成的單純性甲基丙二酸血癥和cblC、cblD、cblF構(gòu)成的血癥合并同型胱氨酸血癥，且大多為鈷胺素有效型[13]。國外研究發(fā)現(xiàn)單純性甲基丙二酸血癥發(fā)病率遠(yuǎn)高于甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸[14]，在我國甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥患者占甲基丙二酸血癥患者的59.7%[15]，這潛在提示著甲基丙二酸血癥具有種族差異性。甲基丙二酸血癥合并同型胱氨酸血癥主要由cblC缺陷即MMACHC基因突變所致，也是最常見的鈷胺素代謝障礙性疾病[16]。本研究中的1例患兒是MMACHC基因突變所致，且確診患兒血同型半胱氨酸增高(63 μmol/L,參考值5～20 μmol/L)，應(yīng)為cblC型合并同型胱氨酸血癥，這與我國甲基丙二酸血癥常見類型報道相符。國內(nèi)有學(xué)者曾對79例中國 cblC缺陷患者進行研究，發(fā)現(xiàn)有48.1%的c.609G>A(p.W203X)突變發(fā)生率，其次c.658～660del AAG的突變率為13.9%[17]。另有報道16例合并型甲基丙二酸血癥患兒基因檢測中發(fā)現(xiàn)81%的c.609G>A和c.658～660del AAG突變[18]。在本研究中，確診患兒MMACHC基因存在c.609G>A(p.Trp146Ter)和c.658～660del AAG(p.Lys163del)位點雜合突變，這與報道也相一致。且c.609G>A和c.658～660del AAG曾被報道為致病突變，與甲基丙二酸血癥的發(fā)生有關(guān),這與確診患兒的血尿檢測結(jié)果也相吻合。對該例患兒建議保證足夠的天然蛋白質(zhì)攝入，同時可用鈷胺素、葉酸、甜菜堿、左卡尼汀進行治療[19]。

丙酸血癥是丙酰輔酶A羧化酶缺乏引起的丙酸分解代謝異常的遺傳學(xué)缺陷病，主要以代謝性酮癥酸中毒、發(fā)育遲緩和驚厥為主要特征,與甲基丙二酸血癥有相似的生化特征和臨床癥狀。有研究報道在55例丙酸血癥患者中，有20例是通過新生兒篩查確診的，通過新生兒篩查早期診斷丙酸血癥可以降低病死率[13]。本研究中通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查新生兒遺傳代謝病，發(fā)現(xiàn)的132例疑似丙酸血癥樣本中確診了1例，發(fā)病率約為1/100 000。遺憾的是本研究這例樣本在召回確診前已死亡，血液液相串聯(lián)質(zhì)譜初篩結(jié)果提示為甲基丙二酸血癥和丙酸血癥。筆者對此樣本的干血片做測序，發(fā)現(xiàn)其PCCA和PCCB基因存在突變，這兩基因與丙酸血癥有關(guān)。這說明單純應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜無法準(zhǔn)確診斷和鑒別甲基丙二酸血癥和丙酸血癥，需結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜檢測尿中的甲基丙二酸、3-羥基丙酸的值進行確診[20]。另外，目前實驗室是根據(jù)C3、C3/C2的值來判定是否召回復(fù)查，從初篩-召回復(fù)查-召回確診整個流程需要5周時間，后期可以考慮開發(fā)試劑盒對初篩提示為甲基丙二酸血癥、丙酸血癥的樣本進行二次篩查，盡早對患兒進行確診，為患兒的治療爭取時間。

本研究利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查了近10萬份樣本，甲基丙二酸血癥、丙酸血癥疑似陽性樣本132例，進一步結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)和基因測序確診了1例cblC型合并同型胱氨酸血癥患兒，1例丙酸血癥患兒。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用能夠為甲基丙二酸血癥的初篩提供參考，需密切結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜和測序技術(shù)鑒別診斷丙酸血癥，為疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供指導(dǎo)。