曹睿琪，杜華，孫天成

（南京工業(yè)大學(xué)，江蘇南京 211816）

人類在生態(tài)圈中的活動(dòng)日益頻繁，過(guò)度使用β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類等傳統(tǒng)抗生素對(duì)抗細(xì)菌、真菌等有害微生物，導(dǎo)致部分有害微生物通過(guò)自身進(jìn)化產(chǎn)生強(qiáng)耐藥性。所以打破固有思維，探尋具有拮抗作用的新型抗生素在抗生素發(fā)展中顯得至關(guān)重要。在眾多的革蘭氏陽(yáng)性菌中，芽孢桿菌因?yàn)槟軌蜃援a(chǎn)內(nèi)生孢子具有拮抗作用而獲得越來(lái)越多的關(guān)注。自美國(guó)科學(xué)家Jonson[1]在人體組織中分離出地衣芽孢桿菌后，作為拮抗性芽孢桿菌屬中家族成員之一的地衣芽孢桿菌以其廣譜、高效的抑菌特性成為生物拮抗領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。因此以活化地衣芽孢桿菌為基礎(chǔ)，將枯草芽孢桿菌、里氏木霉、大腸桿菌作為指示菌，對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行篩選；同時(shí)用濾紙片法測(cè)定抑菌圈直徑大小，分析拮抗性芽孢桿菌的抑菌性能；并采用單因素變量法，分析發(fā)酵培養(yǎng)基不同成分對(duì)拮抗性地衣芽孢桿菌的拮抗性能影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

指示菌：枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，里氏木霉；待篩菌：地衣芽孢桿菌。菌種來(lái)源：南京工業(yè)大學(xué)國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 mL，NaCl 5 g，淀粉30 g，濃度為3.08%濃度的MgSO410 mL，水1 000 mL[2]。

1.1.3 真菌PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)至自然pH。

1.1.4 待篩菌發(fā)酵培養(yǎng)基

濃度為1.5%的葡萄糖，3%的蛋白胨，0.15%的CaCl2等，調(diào)pH值至中性，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器設(shè)備

ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；YX280D高壓滅菌鍋，上海海埃塞克生物科技有限公司；OMP200A電子天平，上海第二天平儀器廠；HI9214 pH測(cè)定儀，蘇州海云天儀器儀表有限公司；500-182-30游標(biāo)卡尺，上海辛睿電器科技有限公司；SP-756P紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

移液槍轉(zhuǎn)移100～300 μL菌液至平板中，涂布，完成后灼燒涂布棒，再進(jìn)行三區(qū)劃線；殺死接種環(huán)多余菌，最后打開(kāi)三區(qū)劃線平板，取一個(gè)單菌落，再打開(kāi)LB培養(yǎng)基，中間劃線后進(jìn)行密集劃線。

1.3.2 種子液培養(yǎng)

取培養(yǎng)好的斜面，將密集劃線后長(zhǎng)好菌的平板放至室溫，同時(shí)將種子液放入超凈臺(tái)進(jìn)行紫外滅菌。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌采用細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，里氏木霉采用真菌發(fā)酵培養(yǎng)基，待篩芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基見(jiàn)1.1.4。

1.3.4 芽孢桿菌篩選

1.3.4.1 指示平板

分別將枯草芽孢桿菌，大腸桿菌和里氏木霉菌液加入到標(biāo)準(zhǔn)平板中，再分別加入3種指示菌的培養(yǎng)基20 mL，輕微振蕩，水平放置后制備成指示菌平板[3]。

1.3.4.2 初篩

先以枯草芽孢桿菌為指示菌對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行初篩，取菌株上清液過(guò)0.22 μm的濾膜，選擇輕薄的紙片，將這些紙片裁剪成方形，蘸取待測(cè)地衣芽孢桿菌發(fā)酵液，將紙片均勻貼在指示平板的表面，把濾紙片周?chē)黠@產(chǎn)生透明抑菌圈的地衣芽孢桿菌分別編號(hào)為H29、28、30、31、32，并用游標(biāo)卡尺測(cè)定5種菌株抑菌圈直徑大小，篩選出拮抗作用最強(qiáng)的地衣芽孢桿菌。

1.3.4.3 復(fù)篩

將初篩得出的拮抗作用最強(qiáng)的拮抗性地衣芽孢桿菌菌株用接種環(huán)挑出，再分別用枯草芽孢桿菌、里氏木霉、大腸桿菌作為指示菌來(lái)觀察抑菌圈透明圈，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量大小，驗(yàn)證該菌株是否具有普遍抗菌活性。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)化

對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，將復(fù)篩選出的拮抗性地衣芽孢桿菌于斜面活化，再接種后對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)采用濾紙片法測(cè)定產(chǎn)抗菌肽的該地衣芽孢桿菌的抑菌圈直徑[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈直徑測(cè)定

如表1所示，初篩以枯草芽孢桿菌為指示菌，用游標(biāo)卡尺對(duì)編號(hào)H29、28、30、31、32的5種菌株進(jìn)行抑菌圈大小測(cè)量，結(jié)果32＞H29＞28＞31＞30，最大抑菌圈直徑達(dá)到18.56 mm。如表2所示，復(fù)篩對(duì)32菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，再以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、里氏木霉為指示菌，測(cè)定32菌株的抑菌圈大小。復(fù)篩結(jié)果表明，以枯草芽孢桿菌為指示菌時(shí)，32地衣芽孢桿菌抗菌能力最強(qiáng)，抑菌圈大小可達(dá)18.57 mm。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

復(fù)篩結(jié)果表明，以枯草芽孢桿菌為指示菌，地衣芽孢桿菌32抑菌圈大小最大，即產(chǎn)抗菌肽能力最強(qiáng)，所以重點(diǎn)對(duì)地衣芽孢桿菌32進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。以C源（葡萄糖）為單變量，設(shè)置葡萄糖濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%[4]，N源（蛋白胨）保持為3%，無(wú)機(jī)鹽（CaCl2）保持為0.15%，配制5瓶培養(yǎng)基，再以枯草芽孢桿菌為指示菌，重復(fù)濾紙片法進(jìn)行抑菌圈測(cè)定，如圖1所示為抑菌圈大小。當(dāng)葡萄糖量為1.0%時(shí)，地衣芽孢桿菌32抑菌圈直徑最大，拮抗性能最強(qiáng)，且拮抗性能隨葡萄糖濃度增大而下降。

表1 地衣芽孢桿菌抑菌圈測(cè)定結(jié)果（初篩）

表2 地衣芽孢桿菌抑菌圈測(cè)定結(jié)果（復(fù)篩）

圖1 葡萄糖濃度對(duì)拮抗性能的影響

以N源（蛋白胨）為單變量，設(shè)置蛋白胨濃度為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%，保持C源1.0%、無(wú)機(jī)鹽0.15%，配制5瓶培養(yǎng)基，分別得到抑菌圈大小如圖2所示。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.0%時(shí)，地衣芽孢桿菌32抑菌圈直徑最大，拮抗性能最強(qiáng)。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.0%～3.0%時(shí)，拮抗性能逐漸增大，而蛋白胨濃度為3.0%～4.0%時(shí)，拮抗性能逐漸減小。

以無(wú)機(jī)鹽（CaCl2）為單變量，設(shè)置無(wú)機(jī)鹽濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%，保持C源1.0%、N源3.0%，配制5瓶培養(yǎng)基，分別得到抑菌圈大小如圖3所示。當(dāng)CaCl2添加量為0.15%時(shí)，地衣芽孢桿菌32抑菌圈直徑最大，拮抗性能最強(qiáng)。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.05%～0.15%時(shí)，拮抗性能逐漸增大，而蛋白胨濃度為0.15%～0.25%時(shí)，拮抗性能逐漸減小。

圖2 蛋白胨濃度對(duì)拮抗性能的影響

圖3 CaCl2添加量對(duì)拮抗性能的影響

3 結(jié)論

芽孢桿菌屬中地衣芽孢桿菌具有良好的拮抗性能，在以枯草芽孢桿菌為指示菌進(jìn)行初篩條件下，編號(hào)H29、28、30、31、32菌株的拮抗性能也不同。復(fù)篩時(shí)以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、里氏木霉作為指示菌對(duì)菌株32測(cè)定抑菌圈大小，發(fā)現(xiàn)枯草桿菌為指示菌時(shí)抑菌圈最大。單因素實(shí)驗(yàn)表明，葡萄糖添加量為1%、蛋白胨添加量為3%、CaCl2添加量為0.15%時(shí)，地衣芽孢桿菌32抑菌圈直徑最大。