劉芯宇，周昱彤，趙婷，溫道健，翟銳銳，姚瑰瑋，艾朝輝

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199）

刺芫荽（Eryngium foetidum L）. 又稱刺芹、洋芫荽、野芫荽、假芫荽、大葉芫荽、緬芫荽、阿佤芫荽等，為傘形科刺芹屬多年生草本植物，目前在世界范圍內(nèi)主要分布于拉丁美洲、東南亞和非洲等地區(qū)[1]，在中國主要分布于海南、廣東、廣西、云南等熱帶或亞熱帶地區(qū)[2，3]。刺芫荽通常以全草入藥，可用于治療感冒寒咳、哮喘、胃氣痛、產(chǎn)后出血、跌打損傷、腸炎腹瀉、消化不良、胸痛、麻疹內(nèi)陷、氣管炎、急性傳染性肝炎、蛇咬傷等癥[4～7]。

黃酮類化合物對(duì)多種腫瘤具有預(yù)防、治療或化療增敏作用，還具有降血糖、降血脂、降壓、鎮(zhèn)痛和抗炎作用[8，9]。若將總黃酮含量較高的刺芫荽只作為香料佐料使用，無疑是一種資源的巨大浪費(fèi)。林華銘等[6]用乙醇回流提取法對(duì)刺芫荽總黃酮提取工藝進(jìn)行了研究，提取黃酮的時(shí)間為1.5 h，試驗(yàn)耗時(shí)比較長。超聲波輔助法提取黃酮是利用超聲波不斷振蕩提取液，破壞細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)通過細(xì)胞膜的透過率，有利于提取物的釋放，與其他提取方法相比具有省時(shí)、高效、雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)[10～15]。但截至目前，用超聲波輔助法提取刺芫荽中總黃酮的研究尚未見報(bào)道。近年來黃酮清除自由基的抗氧化劑研究引起了人們的關(guān)注，黃酮類化合物一直是人們關(guān)注的天然抗氧化劑之一[16～21]。目前，尚未見到有關(guān)刺芫荽總黃酮提取物抗氧化活性研究的報(bào)道。

鑒于此，利用超聲輔助法提取刺芫荽中的總黃酮，通過單因素試驗(yàn)篩選工藝因素的適宜水平，再利用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化；并通過分析對(duì)羥基自由基（·OH） 和DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼） 自由基的清除效果以及抗油脂過氧化能力，對(duì)刺芫荽總黃酮提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨為合理開發(fā)刺芫荽資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材 刺芫荽：采摘于海南，經(jīng)鑒定為刺芫荽全草，40 ℃烘干后粉碎至40～60 目，備用。玉米油、大豆油：購于超市。

1.1.2 儀器 粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；分析天平：瑞士METILER；752 型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-S26 水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III） 循環(huán)水真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.1.3 試劑 蘆丁對(duì)照品：中國藥品生物制品檢定所，純度≥99%；Vc、氯仿、冰醋酸、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、無水乙醇、碘化鉀、磷酸緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH 等：均為分析純，廣州化學(xué)試劑公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 刺芫荽總黃酮的提取工藝 取刺芫荽粉末，加入乙醇溶劑，控制超聲波水浴溫度和超聲時(shí)間，進(jìn)行總黃酮的提取。

1.2.2 刺芫荽總黃酮得率的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品32 mg，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶解并定容至100 mL，配成0.32 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，搖勻，備用。

分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0（空白）、1.00、2.00、3.00、4.00 和5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，制成濃度分 別 為0、0.012 8、0.025 6、0.038 4、0.051 2 和0.064 0 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液10 mL；用60%乙醇定容，搖勻，靜置15 min。用分光光度計(jì)在波長510 nm 處測定吸光度。以溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 總黃酮含量測定。精密稱取刺芫荽粉末1.0 g，加入60%乙醇溶劑20 mL 浸泡過夜；在超聲波水浴溫度60 ℃條件下，超聲提取20 min；將提取液過濾，并置于50 mL 容量瓶中，用乙醇溶劑定容至刻度。移取該溶液5 mL 于25 mL 容量瓶中，加入顯色劑顯色，用分光光度計(jì)在波長510 nm 處測定吸光度。根據(jù)溶液濃度—吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到總黃酮含量。根據(jù)公式，計(jì)算刺芫荽中的總黃酮得率：

總黃酮得率（%） =刺芫荽黃酮含量∕刺芫荽重量×100%

1.2.3 刺芫荽總黃酮超聲提取工藝條件的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)[10～15]。考察因素為乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比（mL/g）、提取溫度。改變其中1 個(gè)因素的水平，固定其他3 個(gè)因素水平，進(jìn)行刺芫荽總黃酮的提取。分析單因素不同水平對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響，根據(jù)總黃酮得率篩選某個(gè)因素的適宜水平。每處理均3 次重復(fù)。

（1） 乙醇濃度對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份刺芫荽粉末，試驗(yàn)乙醇濃度設(shè)40%、50%、60%、70%、80%計(jì)5 個(gè)處理，固定因素為料液比1∶20、超聲溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min。

（2） 提取溫度對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份刺芫荽粉末，試驗(yàn)超聲溫度設(shè)40、50、60、70、80 ℃計(jì)5 個(gè)處理，固定因素為乙醇濃度60%、料液比1∶20、提取時(shí)間30 min。

（3） 料液比對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份刺芫荽粉末，試驗(yàn)料液比設(shè)1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1∶25、1∶30 計(jì)5 個(gè)處理，固定因素為乙醇濃度60%、超聲溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min。

（4） 提取時(shí)間對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響。準(zhǔn)確稱取5 份刺芫荽粉末，試驗(yàn)提取時(shí)間設(shè)10、20、30、40、50 min 計(jì)5 個(gè)處理，固定因素為乙醇濃度60%、料液比1∶20、超聲溫度60 ℃。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用乙醇濃度（因素A）、料液比（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、超聲溫度（因素D） 四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行刺芫荽總黃酮的提取，確定最佳提取工藝條件。選用優(yōu)化后的工藝條件提取刺芫荽中的總黃酮，對(duì)提取工藝的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 刺芫荽總黃酮的抗氧化活性 分別測定刺芫荽總黃酮對(duì)·OH 和DPPH 自由基的清除率，以及對(duì)大豆油和玉米油的抗氧化活性。

1.2.4.1 對(duì)·OH 的清除率。參考孟良玉等[16]方法測定。將提取的黃酮用旋轉(zhuǎn)儀蒸發(fā)成膏狀，再用蒸餾水將其配成質(zhì)量濃度分別為0.24、0.30、0.36、0.48、0.60、0.72 mg/mL 的黃酮溶液，并分別移取黃酮溶液2 mL 于容量瓶中。依次加入9 mmol/L 的FeSO4溶液和8.8 mmol/L 的H2O2各1 mL，混合均勻，室溫下靜置10 min；再加入9 mmol/L 的水楊酸2 mL，混合均勻，室溫下靜置30 min。用分光光度計(jì)在波長510 nm 處測定吸光度。用蒸餾水代替水楊酸作為空白對(duì)照，并測定吸光度。根據(jù)公式，計(jì)算·OH 的清除率：

E（·OH） （%） ＝［1-（A1-A2） /A0］×100%

式中，E（·OH） —羥基自由基的清除率（%）；A0—空白吸光度；A1—總黃酮提取物反應(yīng)的吸光度；A2—水楊酸參加反應(yīng)時(shí)總黃酮提取物的吸光度。

1.2.4.2 對(duì)DPPH 自由基的清除率。參考張曉璐等[17]方法測定。配制質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的刺芫荽總黃酮待測液；分別取待測液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL 比色管中，加入濃度0.04 mg/mL 的DPPH 溶液2 mL，再加95%乙醇至10 mL，混合均勻，室溫下放置20 min；離心，取上清液，用分光光度計(jì)在波長517 nm 處測定吸光度（A1）。另分別取待測液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 置于比色管中，加入95%乙醇至10 mL，其他操作同上，測定吸光度（A2）；用0.04 mg/mL 的DPPH 溶液2 mL 與95%乙醇8 mL的混合液作為參比，其吸光度記為（A0）。用質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的Vc 溶液代替總黃酮進(jìn)行上述試驗(yàn)，作為對(duì)照。根據(jù)公式，計(jì)算DPPH 自由基的清除率：

E（DPPH） =［1-（A1-A2） /A0］×100%

式中，E（DPPH） —總黃酮提取液對(duì)DPPH 自由基的清除率（%）；A0—DPPH 溶液＋95%乙醇反應(yīng)后的吸光度；A1—DPPH 溶液+不同體積總黃酮提取液的吸光度；A2—95%乙醇+總黃酮提取液的吸光度。

1.2.4.3 對(duì)油脂的抗氧化活性。參考孟良玉等[16]方法測定。取250 mL 的燒杯6 只，分別加入大豆油100 g；另取250 mL 的燒杯6 只，分別加入玉米油100 g。試驗(yàn)設(shè)刺芫荽總黃酮加入量0、0.2、0.4、0.6、0.8 g 計(jì)5 個(gè)處理，以加入Vc 0.2 g 作為對(duì)照；將油樣置于（65±1） ℃的烘箱中，每隔2 d 測定1 次過氧化值（POV，用過氧化物的毫克當(dāng)量數(shù)表示）。每次取油樣2～3 g，置250 mL 具塞錐形瓶中，加入三氯甲烷與冰乙酸的混合液30 mL，立即振搖使其溶解；加入飽和碘化鉀溶液1 mL，蓋上塞子搖勻，在黑暗處放置3 min；加入蒸餾水100 mL，搖勻，并立即用0.002 mol/L 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡黃色，再加入淀粉指示劑1 mL 繼續(xù)滴至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。并取相同量的三氯甲烷-冰乙酸溶液以及碘化鉀溶液和蒸餾水，按照同一方法做空白試驗(yàn)。根據(jù)公式，計(jì)算POV：

POV（meq/kg） =（V1－V2） N/W×1 000

式中，V1—試樣用去硫化硫酸鈉溶液的體積（mL）；V2—空白試驗(yàn)用去的硫代硫酸鈉溶液體積（mL）；N—硫代硫酸鈉溶液的當(dāng)量濃度（mol/L）；W—試樣質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、濃度（C） 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到回歸方程為A=10.18C＋0.003 7，R2=0.999 6。表明在溶液濃度為0.012 8～0.064 0 mg/mL時(shí)，吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響 隨著乙醇濃度的增大，刺芫荽總黃酮得率呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中乙醇濃度為60%時(shí)指標(biāo)值最大，此時(shí)總黃酮得率為1.062%（圖2）。因此，篩選適宜的乙醇濃度為60%。

2.1.2 提取溫度對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響 隨著提取溫度的升高，刺芫荽總黃酮得率呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中提取溫度為70 ℃時(shí)指標(biāo)值最大，此時(shí)總黃酮得率為0.857 8%（圖3）。因此，篩選適宜的提取溫度為70 ℃。

2.1.3 料液比對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響 隨著料液比的增大，刺芫荽總黃酮得率呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中料液比為1 ∶25 時(shí)指標(biāo)值最大，此時(shí)總黃酮得率為0.988 0%（圖4）。因此，篩選適宜的料液比為1∶25。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響 隨著提取時(shí)間的延長，刺芫荽總黃酮得率呈先增加后降低的趨勢(shì)變化，其中提取時(shí)間為40 min 時(shí)指標(biāo)值最大，此時(shí)總黃酮得率為0.988 0%（圖5）。因此，篩選適宜的提取時(shí)間為40 min。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）進(jìn)行四因素三水平的L934正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。RA＞RB＞RD＞RC（表2），表明4 個(gè)因素對(duì)刺芫荽總黃酮得率的影響順序?yàn)橐掖紳舛龋玖弦罕龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。在試驗(yàn)因素的設(shè)計(jì)水平范圍內(nèi)，優(yōu)化提取刺芫荽總黃酮的最佳條件為A1B2C3D3，即乙醇濃度50%、料液比1∶25、提取時(shí)間50 min、提取溫度80 ℃。

表1 L934 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及其水平Table 1 The factors and levels of L934 orthogonal experimental design

表2 正交試驗(yàn)的刺芫荽總黃酮得率Table 2 The total flavonoids yield by orthogonal experiment

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，選用優(yōu)選化的工藝條件提取刺芫荽總黃酮平均得率為1.385%，RSD 為1.55%，高于其他條件下的總黃酮得率。表明利用正交試驗(yàn)優(yōu)選出的A1B2C3D3超聲條件參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.4 黃酮的體外抗氧化活性

2.4.1 對(duì)·OH 的清除率 黃酮和Vc 對(duì)·OH 的清除率均隨溶液濃度的增大而遞增，在濃度0.048～0.144 mg/mL范圍內(nèi)，黃酮對(duì)·OH 的清除率為13.99%～39.82%，與Vc 對(duì)·OH 的清除率（13.70%～43.21%） 基本相當(dāng)（圖6）。表明刺芫荽總黃酮對(duì)·OH 具有較好的清除能力。

2.4.2 對(duì)DPPH 自由基的清除率 黃酮和Vc 對(duì)DPPH自由基的清除率均隨溶液濃度的增大而遞增，在濃度0.048～0.144 mg/mL 范圍內(nèi)，黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除率為55%～70%，低于Vc 對(duì)DPPH 自由基的清除率（83%～90%） （圖7）。表明刺芫荽總黃酮對(duì)DPPH 自由基有一定的清除能力。

2.4.3 抗油脂氧化能力 玉米油和大豆油加入黃酮后，油脂的POV 均明顯低于其未加入黃酮處理；但不同濃度黃酮的抗油脂氧化能力不同，在質(zhì)量濃度0～0.8%范圍內(nèi)，黃酮的抗油脂氧化能力隨著溶液濃度的增大而遞增（圖8 和9）。在質(zhì)量濃度為0.2%條件下，Vc處理的抗油脂氧化能力明顯高于黃酮處理。進(jìn)一步分析刺芫荽總黃酮對(duì)不同油脂的氧化抑制作用發(fā)現(xiàn)，相同濃度條件下，其對(duì)玉米油與對(duì)大豆油的抗氧化能力大體相當(dāng)。表明刺芫荽總黃酮可以明顯抑制油脂氧化，在0.2%質(zhì)量濃度下刺芫荽總黃酮的抗油脂氧化活性弱于Vc。

3 結(jié)論與討論

采用超聲輔助法提取刺芫荽中的總黃酮，通過單因素試驗(yàn)對(duì)提取工藝中的單因素水平進(jìn)行了篩選；在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)刺芫荽中總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙醇濃度對(duì)刺芫荽總黃酮得率影響最大、超聲時(shí)間影響力度最小，最佳提取條件為乙醇濃度50%、料液比1 ∶25、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間50 min，該條件下總黃酮得率為1.385%。在低的乙醇濃度范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增大，刺芫荽細(xì)胞發(fā)生溶脹現(xiàn)象，細(xì)胞中的黃酮類化合物溶出增加，刺芫荽總黃酮得率升高；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大，根據(jù)相似相溶的原理，高濃度的乙醇溶液會(huì)溶解細(xì)胞中的色素、脂溶性等物質(zhì)，從而使得總黃酮得率降低[10～12]。因此，在提取黃酮生產(chǎn)中，應(yīng)注意乙醇濃度的控制。

在本研究中還對(duì)刺芫荽總黃酮的體外抗氧化能力進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，刺芫荽總黃酮提取物對(duì)·OH和DPPH 自由基均具有較好的清除能力，也具有較好的抗油脂氧化能力，但對(duì)DPPH 自由基的清除能力和抗油脂氧化能力弱于Vc。分析原因可能是使用的刺芫荽總黃酮為粗提物，未經(jīng)過分離純化，含有較多雜質(zhì)，進(jìn)而影響了其抗氧化活性。這也為刺芫荽黃酮類化合物的進(jìn)一步探索與開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。