肖 聰，陳小玲,方睿霞,高艷菊,張 東,王石發(fā),王保秀,楊青松*

（1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委教育部重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

近年來連續(xù)流動分析儀被大量應(yīng)用于各個領(lǐng)域，如測定土壤氨氮、硝態(tài)氮和有效磷[1-2]，測定水中氨氮的方法比較[3]、復(fù)混肥料中硝態(tài)氮[4]，同時測定橡膠葉全氮、全磷、全鉀的方法研究[5]，快速測定全氮、全磷含量[6-7]。AA3連續(xù)流動分析儀擁有先進的自動化技術(shù)優(yōu)勢和超700種被認證的方法應(yīng)用，由于自動化和模塊化設(shè)計，AA3可以很容易地適應(yīng)各實驗室特殊的技術(shù)和實驗要求，可根據(jù)相應(yīng)方法分析40～100個樣品/h，120～180個樣品/d。能夠分析各類型澄清液體樣品，如水（海水/自來水/廢水）、土壤（浸提液/消煮液）、植物（消煮液）、食品（飲料）、肥料、化合物等。

川滇高山櫟 (Quercus aquifolioides Rehd.et Wils.)系殼斗科櫟屬的植物。分布于云南、西藏、貴州、四川等地，常生長在山坡向陽處或高山松林下[8]。常與其他高山櫟類樹種混生，是我國西部和西南部青藏高原東緣以及橫斷山地區(qū)所特有的一種植被類型，其分布區(qū)內(nèi)對環(huán)境條件有極強的生態(tài)適應(yīng)性，使得東喜馬拉雅和橫斷山地區(qū)的森林覆蓋率大大增加，在當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[9]。前人對川滇高山櫟研究多集中在生態(tài)功能研究方面[10-13]，對川滇高山櫟植物營養(yǎng)方面的研究較少，其中利用AA3型連續(xù)流動分析儀快速測定高山櫟枝葉氮磷養(yǎng)分方面的研究尚未見報道。本文對AA3型連續(xù)流動分析儀測定川滇高山櫟枝葉消解樣品中全氮/全磷含量的方法進行研究，獲得高效、精確的方法，以提高AA3型連續(xù)流動分析儀測定川滇高山櫟全氮/全磷養(yǎng)分含量的質(zhì)量和效率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品：川滇高山櫟枝葉試驗樣品，均為野外采集；采樣點為云南省昆明市祿勸縣轎子雪山。國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW07603（GSV-2）灌木枝葉購自中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所。

實驗試劑：鉬酸銨(NH4)6Mo7O24·4H2O、磷酸二氫鉀KH2PO4、抗壞血酸C6H8O8、酒石酸銻鉀K(SbO)C4H4O6·1/2H2O、硫酸鉀 K2SO4、十二烷基硫酸鈉（SDS）C12H25NaO4S、優(yōu)級純、10%次氯酸鈉NaOCl、濃硫酸H2SO4（比重 1.84）、濃鹽酸 HCl（比重 1.18）、30%過氧化氫 H2O2、硫酸銨 (NH4)2SO4、Brij-35 溶液 22%、硫酸鉀K2SO4、氫氧化鈉NaOH、磷酸氫二鈉 Na2HPO4、水楊酸鈉 Na2C7H5O3、硝普鈉 Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O、酒石酸鉀鈉C4H4KNaO6·4H2O。 除特殊說明外所有試劑為分析純，水為去離子水。

主要實驗儀器：AA3型連續(xù)流動分析儀CFA，由德國SEAL公司生產(chǎn)，二通道，均為 MT7模塊；SH230N石墨爐重金屬消解儀 （可控溫控時，配套30根100mL玻璃消煮管）；WGL-125B電熱鼓風(fēng)干燥箱（可控溫控時）。

1.2 方法

1.2.1 樣品待測液的制備

前處理：將采集的新鮮高山櫟枝葉放入105℃烘箱中殺青30 min，再用75℃烘干至恒重（需要8～12 h）。最終粉碎后裝入密封袋。

消煮具體步驟：采用硫酸-過氧化氫法消煮植物樣，精密稱取樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.0500 g于50 mL刻度的玻璃消煮管中，加入0.5 mL去離子水，潤濕樣品后加入1.2mL濃H2SO4，搖勻，靜置過夜。消煮程序：150℃ 1h，200℃ 1h，240℃ 1.5h，消煮至樣品呈黑醬油狀態(tài)。將消煮管取出稍微冷卻約1 min后，在溶液中間加過氧化氫10滴，邊滴加邊搖勻，直至消煮液變?yōu)楦吻宓暮卺u油狀態(tài)，基本沒有固體。再加5滴過氧化氫，消煮液顏色呈深黃色的澄清液體。樣品統(tǒng)一滴加過氧化氫的滴數(shù)和次數(shù)，反復(fù)消化，直至變無色后繼續(xù)再消化20 min除去殘留的過氧化氫。最后加去離子水約50 mL于消解管中，待冷卻穩(wěn)定后轉(zhuǎn)移至100 mL帶蓋比色管中定容及混勻（酸度為1.2%H2SO4）。同時做空白試驗，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品同樣處理。將制備好的待測液于4℃冰箱保存。

1.2.2 全氮和全磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[14～15]

全氮標(biāo)準(zhǔn)貯液（1000 mg N/L）：精密稱取已在烘箱130℃烘3h的硫酸銨4.717 g，溶于600 mL去離子水中，定容至1L后搖勻，于4℃冰箱保存。全磷標(biāo)準(zhǔn)貯液（1000 mg P/L）：精密稱取已在烘箱130℃烘3h的磷酸二氫鉀4.394 g，溶于600 mL去離子水中，定容至1L后搖勻，儲于4℃冰箱保存。

取全氮標(biāo)準(zhǔn)貯液 （1000 mg N/L）0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 和全磷標(biāo)準(zhǔn)貯液（1000 mg P/L）0、0.1、0.2、0.3、0.4mL于5個100 mL的容量瓶中，在每個容量瓶中加空白消煮液1.2 mL，用去離子水定容后搖勻。 其中含 N：0、2、4、6、8 mg/L，含 P：0、1、2、3、4 mg/L。

1.2.3 AA3型連續(xù)流動分析儀操作步驟[16]

CFA具體操作步驟參照操作規(guī)程按部進行，簡單步驟為：開主機開泵，預(yù)熱2h，待氣泡穩(wěn)定后打開軟件、進樣器和檢測器，待泵停下后點圖表選擇分析方法，出現(xiàn)運行頁面，關(guān)閉不需要的通道運行頁面。設(shè)置燈值和基線，待水基線穩(wěn)定在5%（約30min），放入試劑，檢查試劑吸收（12 min 左右），試劑吸收滿足條件后設(shè)置增益（約15 min），增益成功后設(shè)立分析方法，關(guān)閉通道運作分析文件，運行結(jié)束后取回報告，輸出并分析數(shù)據(jù)，最后用系統(tǒng)清洗液慢速清洗管路15 min。

本次試驗測全氮全磷含量時，儀器所使用的通道為channel-2通道，基線默認5%，增益初始值為10（增益值應(yīng)小于100，不然峰形不穩(wěn)定），增益最高峰為85%，視圖平滑度設(shè)為16，設(shè)置了漂移基線校正杯和帶過杯。測定樣品時要先檢查試劑吸收和儀器靈敏度。試劑吸收和儀器靈敏度公式為：相對于水的試劑吸收值=[試劑吸收（%）-水基線（5%）]/100%；設(shè)置試劑基線為5%，泵入氮磷標(biāo)準(zhǔn)最高杯，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液到達檢測器且峰信號出現(xiàn)時，記錄其峰高（%），則靈敏度=[最高標(biāo)曲峰高（%）-試劑基線（5%）]/100%，靈敏度結(jié)果會在樣品運行結(jié)束后自動計算，出現(xiàn)在實驗分析報告上。

1.2.4 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2013軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑配制方法的調(diào)整和特性參數(shù)的設(shè)置結(jié)果

參照儀器所附方法和文獻[5,14-15]，試劑配置方法做了相應(yīng)的調(diào)整 （樣品消解后最終酸度為1.2%H2SO4）。根據(jù)最終樣品酸度，全磷全氮進樣器清洗液為1.2%H2SO4（試劑管①，圖1），空氣管為②⑤，進樣管為④或⑦。

全氮的試劑配制方法：

未做改變的試劑為水楊酸鈉溶液 （試劑管⑧，圖1），稀釋水為去離子水（試劑管⑩）；其余試劑作如下調(diào)整：緩沖溶液（試劑管③⑥，圖1）稱取35.3 g十二水磷酸氫二鈉和50 g酒石酸鉀鈉溶于400 mL的去離子水中，用小燒杯稱取22 g氫氧化鈉，轉(zhuǎn)移至上述溶液中，混合均勻后后稀釋至1 L。最后在瓶中加入2.73 mL Brij-35（22%）。要盡快用完，即使放入4℃冰箱，一天后出現(xiàn)渾濁，不可使用；次氯酸鈉溶液（試劑管⑨，圖1）配制方法為取10%次氯酸鈉10mL，用9.05 mL的去離子水稀釋成5.25%次氯酸鈉，取7 mL 5.25%次氯酸鈉溶液至60 mL水中，稀釋至100 mL，混勻，每天更新。通過試劑配制調(diào)整，全氮反應(yīng)尾液最終pH值為12.89，符合要求。

全磷的試劑配制方法：

未改變試劑為抗壞血酸溶液（試劑管⑩，圖1），稀釋水為去離子水（試劑管⑧，圖1）；將儀器所附方法中鹽溶液配置的酸去掉，將酸溶液換成系統(tǒng)清洗液，鉬酸銨溶液（試劑管⑨，圖1）配制方法為：將71 mL的濃硫酸緩慢加入800 mL的去離子水中，將6.2 g鉬酸銨溶于其中，將溶解于水中的0.17 g酒石酸銻鉀溶液加入上面溶液，最后稀釋至1000 mL（其中含2.6 mol/L的1/2 H2SO4），混勻后儲于棕色瓶，每周更新。要將酒石酸銻鉀先溶解再與其他溶液混勻，這樣更容易溶解，試劑吸收也會更低；鹽溶液（試劑管⑥，圖1）配制方法為將5 g氯化鈉溶于700 mL的去離子水，并稀釋至1 L；系統(tǒng)清洗液為0.2%SDS（試劑管③，圖 1）：因 SDS的量影響試劑吸收，所以將2g SDS的量改為1g。

此次實驗全氮和全磷用的都是高濃度進樣管進樣，測定范圍為全氮 0～12 mg/L，全磷 0～6 mg/L。測定速率為50個樣/h，比儀器方法60個樣/h要小，使得增益值良好且視圖更穩(wěn)定。由表1可知，氮磷的靈敏度分別為0.364和0.2764，均大于儀器方法要求的（全氮0.30，全磷0.16）。氮磷的試劑吸收分別為0.019和0.007，均小于儀器方法要求的（氮磷都為0.02）。氮全的帶過% 分別為0.13%和0.37%，均小于儀器方法要求的（全氮0.5%，全磷1.2%）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

全氮全磷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方程分別為：y＝-0.0002x2+7.2793x+5.0447 和 y＝0.0014x2+15.0736x+18.7397。由圖2可看出氮磷標(biāo)曲線性良好，R2均為 1.0000，高于儀器的線性要求（N:0.9991，P:0.9999），表明AA3型連續(xù)流動分析儀可以快速且準(zhǔn)確地測定氮磷混合標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。全氮/全磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白均高于原點（圖2），這是為了使標(biāo)曲溶液和樣品成分一致，在標(biāo)曲系列中加了消解的空白樣的原因。

表1 CFA測定全氮/全磷方法的特性參數(shù)設(shè)置Table 1 The characteristic parameter for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.3 方法精密度測試結(jié)果

用CFA分別測定5種不同全氮/磷濃度梯度的待測液，重復(fù)測定10次，計算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù) （見表2）。氮磷的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在0.017～0.038 mg/L 和 0.002～0.004 mg/L 范圍內(nèi)，滿足儀器方法要求 （N:0.03 mg/L，P:0.0032 mg/L），全氮/全磷的變異系數(shù)（%）分別在0.276～0.776和0.552～0.919之間，均小于1%，表明具有較好的重現(xiàn)性。

表2 CFA測定全氮/全磷方法的重復(fù)性Table 2 Repeatability for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

表3 CFA測定全氮/全磷方法的最低檢出限Table 3 The lowest detection limit for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

表4 CFA測定全氮/全磷方法的空白加標(biāo)回收率Table 4 The blank spike recovery of determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.4 方法最低檢出限的測試結(jié)果

根據(jù)EPA（美國環(huán)保協(xié)會）測定檢出限的程序[17]，計算標(biāo)準(zhǔn)系列最高點濃度 （N:2mg/L，P:4 mg/L）*2%的濃度值 （N:0.2000 mg/L，P:0.08 mg/L）， 利用AA3連續(xù)流動分析儀重復(fù)測定該值10次 （如表3）。 10次平均值為 N:0.0097mg/L，P:0.0887 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差為N:0.0034，P:0.0032，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差% 為N:1.6132%，P:2.9105%；檢出限=標(biāo)準(zhǔn)偏差 *2.86，氮磷檢出限分別為：N:0.0097mg/L，P:0.0092 mg/L，達到了儀器給出的方法檢測極限（N:0.011mg/L，P:0.02 mg/L）。

2.5 空白加標(biāo)回收率的測試結(jié)果

重復(fù)測量3次4個空白樣的全氮/全磷濃度，用這4個空白樣配置成空白加標(biāo)待測液 （濃度為N:2、4、6、8 mg/L，P:2.5，3，3.5，4.0 mg/L）。 用AA3連續(xù)流動分析儀重復(fù)測量3次空白加標(biāo)待測液的氮磷含量?？瞻准訕?biāo)回收是一種自控的質(zhì)量控制試驗，空白加標(biāo)回收率結(jié)果如表4。由表可看出，全氮全磷的空白加標(biāo)回收率分別在94.2%～100.5%和6.8%～100.5%之間。

表5 CFA測定全氮/全磷方法的相對準(zhǔn)確度Table 5 Relative accuracy for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.6 方法準(zhǔn)確度的測試結(jié)果

根據(jù)區(qū)域地球化學(xué)勘察樣品分析方法[19]上對于方法準(zhǔn)確度參數(shù)的測量與統(tǒng)計，稱取國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（做3個平行樣），和樣品一起消解并重復(fù)測量3次其全氮/全磷濃度，與國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW07603（GSV-2）全氮/全磷認定值（N:15g/kg，P:1g/kg）比較，計算標(biāo)品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和相對準(zhǔn)確度結(jié)果（如表5）。由表可知，經(jīng)國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GSV-2）驗證，氮磷的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值吻合，全氮的方法相對準(zhǔn)確度范圍在99.22%～99.68%之間，全磷的方法相對準(zhǔn)確度在99.76%～105.32%之間，表明具有較好的方法相對準(zhǔn)確度。

3 討論

本實驗所用的CFA測定全氮/全磷方法兩天可成功分析250個川滇高山櫟樣品，很好地提高了實驗效率。當(dāng)一次測量的樣品＞100個樣品，每個樣品測2～3次，最終要測200～300次。為了使實驗數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確[5]，每30個樣品最好插入一組漂移/基線校正杯。當(dāng)然，儀器方法和實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性是基于多種因素的，如樣品的正確前處理、標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性、儀器的穩(wěn)定性、試劑的正確配置、試劑吸收和交叉污染等等，缺一不可，每一個細節(jié)都要注意。

消煮時要根據(jù)消煮液最后的顏色和澄清度，適當(dāng)加溫度或過氧化氫的用量。剛開始只能低溫加熱，微沸即可，爆沸會使樣品濺得過高，樣品損失，消煮難度也加大。建議一天最好只測一批樣品(150個樣品/3h)，清洗管路后再繼續(xù)測第二批樣時，雖省去儀器預(yù)熱的時間，但因儀器工作時間過長，此時儀器的穩(wěn)定性和泵管的彈性都不太理想，實驗結(jié)果很多時候也不滿足要求（如帶過高，視圖曲線不穩(wěn)定等）。

標(biāo)準(zhǔn)樣品必須含有與樣品及樣品清洗液同樣的基體，使酸度基本一致，保證樣品和標(biāo)樣的一致性。根據(jù)樣品待測液酸度來調(diào)整試劑里需要添加的酸堿的量,全氮反應(yīng)混合液（尾液）最終pH值要在12.8～13.1之間。全磷反應(yīng)混合液最終顯色酸度[H+]0.35～0.55 mol/L[20]。全磷試劑吸收很容易高，鉬酸銨溶液配置中鉬酸銨溶于酸中時的試劑吸收比溶于水中的要低[21]，但酒石酸銻鉀不易溶于酸中，易溶于水，所以先將其溶于水中再混合，這樣不僅省時間還能降低試劑吸收。

4 結(jié)論

對AA3型連續(xù)流動分析儀所附方法和文獻報道的磷氮測定方法進行了具體改進后，用來測量川滇高山櫟林枝葉樣品待測液（硫酸-過氧化氫法消煮）中全氮/全磷含量。結(jié)果表明：CFA測定全氮/全磷方法的試劑吸收、靈敏度、帶過%均滿足儀器所附方法要求，基線穩(wěn)定無雜峰，視圖中峰形平滑且規(guī)律。全氮/全磷標(biāo)準(zhǔn)系列線性良好，相關(guān)系數(shù)達到了1.0000，高于儀器的線性要求；氮磷的標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為 0.017～0.038 mg/L 和 0.002～0.004 mg/L，變異系數(shù)范圍為 0.276～0.776%和0.552～0.919%，均小于1%（n＝10），具有較好的重現(xiàn)性；方法檢出限分別為：N:0.0097mg/L P:0.0092 mg/L （n＝10），滿足儀器所附要求；氮磷空白加標(biāo)回收率范圍在94.2%～100.5% 和 96.8%～100.5%之間（n＝3）；經(jīng)國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GSV-2）驗證，氮磷測定值與標(biāo)準(zhǔn)值吻合，全氮的方法相對準(zhǔn)確度范圍在99.22%～99.68%之間，全磷的方法相對準(zhǔn)確度在99.76%～105.32%之間（n＝3），具有較好的方法相對準(zhǔn)確度。