王見之

（復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海200032）

0 引 言

我校微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)涵蓋多種微生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，例如細(xì)菌的染色檢查、人工培養(yǎng)、生化反應(yīng)、藥物的抗菌作用、細(xì)菌性疾病的微生物學(xué)診斷、病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法等教學(xué)實(shí)驗(yàn)［1］。該課程主要目的在于加深學(xué)生對(duì)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)基礎(chǔ)理論知識(shí)的理解、掌握必要的技能、培養(yǎng)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度、訓(xùn)練觀察和記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果及整理分析實(shí)驗(yàn)結(jié)論的能力。其中，細(xì)菌人工培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)乃至臨床醫(yī)學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。但是目前兩種實(shí)驗(yàn)在教學(xué)中仍有不足，可以通過(guò)改良進(jìn)一步提高教學(xué)質(zhì)量和學(xué)生投身科研實(shí)驗(yàn)的興趣。

目前，我校微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中針對(duì)細(xì)菌的人工培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)主要有以下課程安排：細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增在教學(xué)課程前由教師完成，學(xué)生在課堂上只需要?jiǎng)澗€接種即可，然而細(xì)菌的人工培養(yǎng)從培養(yǎng)基的配制、細(xì)菌的接種、培養(yǎng)性狀的觀察都需要學(xué)生掌握。細(xì)菌藥敏試驗(yàn)，即抗生素的抑菌試驗(yàn)，是廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，應(yīng)當(dāng)為廣大醫(yī)學(xué)生所掌握，但是由于目前采用的藥敏試驗(yàn)——紙片擴(kuò)散法的教學(xué)方案雖然難度較小，但是實(shí)驗(yàn)影響因素較多，難以獲得理想的培養(yǎng)結(jié)果，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果，藥敏試驗(yàn)結(jié)果可信度低，也打擊了學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的積極性。

微生物管碟法是測(cè)定抗生素血藥濃度的常用方法。目前，管碟法可用于檢測(cè)商品藥物效價(jià)［2］、提取物抑菌試驗(yàn)［3-4］、菌種抗性監(jiān)測(cè)及選育等［5-6］。利用管碟法測(cè)定血藥濃度的準(zhǔn)確性受多種因素影響［7-8］，本研究針對(duì)管碟法各個(gè)步驟中的常見影響因素，利用臨床上常用藥物青霉素作為測(cè)定對(duì)象進(jìn)行分析，從而建立一種完善可靠的微生物測(cè)定法。本實(shí)驗(yàn)探索簡(jiǎn)單易行的細(xì)菌培養(yǎng)方法，在短時(shí)間教學(xué)過(guò)程中讓同學(xué)們掌握各種細(xì)菌人工培養(yǎng)的方法、練習(xí)多種接種方式、學(xué)會(huì)觀察培養(yǎng)性狀及實(shí)際應(yīng)用等。

1 主要試劑與儀器

注射用青霉素鈉（生產(chǎn)批號(hào)F5092312）購(gòu)自華北制藥股份有限公司；藤黃微球菌（ATCC9341）、抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)購(gòu)自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基、玻璃培養(yǎng)皿（高度約16～17 mm，直徑90 mm）、牛津杯（規(guī)格10 mm×8 mm×6 mm）、分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）由復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)需要潔凈無(wú)抗生素污染，紫外消毒。所有的實(shí)驗(yàn)器材均需滅菌處理。培養(yǎng)皿、牛津杯均為厚薄、大小、重量一致的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。及時(shí)做好實(shí)驗(yàn)菌種的傳代和定期檢查工作，發(fā)現(xiàn)菌種老化需及時(shí)進(jìn)行純化、復(fù)壯。

2.2 待檢樣品制備

清潔級(jí)健康青年Sprague-Dawley大鼠（250±50 g，3月齡）8只和老年SD 大鼠（600±50 g，18月齡）8只，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。腹腔注射青霉素（1萬(wàn)U／100 g體重）60 min后尾靜脈采血，于4℃冰箱靜置1 h，離心（3 000 r／min，10 min）取上清，放入-80℃冰箱保存待用。

2.3 管碟法基本操作步驟

依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典（2010年版）》管碟法測(cè)定［9］，選擇藤黃微球菌（ATCC9341）為質(zhì)控菌種，擴(kuò)增后存入4℃冰箱保存待用。取玻璃平底培養(yǎng)皿，無(wú)菌條件下倒平板，底層為20 mL抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)，菌層5 mL，四象限法放置牛津杯，杯內(nèi)加入血清樣品。另配置青霉素標(biāo)準(zhǔn)液用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。27℃環(huán)境下培養(yǎng)后測(cè)量抑菌圈的直徑，其中最大濃度青霉素標(biāo)準(zhǔn)液產(chǎn)生的抑菌圈直徑應(yīng)處在18～22 mm之間。由于抗生素濃度的對(duì)數(shù)值在一定范圍內(nèi)與其產(chǎn)生的抑菌圈直徑成正比，因此可根據(jù)直線擬合所得青霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中的青霉素濃度［10］。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及影響因素分析

3.1 青霉素標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精確稱取注射用青霉素鈉，利用pH＝7.8的磷酸鹽緩沖液溶解、稀釋、校正后，配制濃度分別為102～106U／L的青霉素標(biāo)準(zhǔn)液。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定對(duì)象是青、老年大鼠，體重介于200～700 g之間，而腹腔注射青霉素劑量為1萬(wàn)U／100 g體重，血清青霉素濃度圍繞103～104數(shù)量級(jí)之間，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)［11］，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制是抑菌試驗(yàn)不確定度的主要來(lái)源，因此設(shè)計(jì)青霉素標(biāo)準(zhǔn)液濃度范圍十分關(guān)鍵，這關(guān)系到回歸方程線性范圍的準(zhǔn)確性。

3.2 細(xì)菌懸液的制備

取藤黃微球菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上，27℃培養(yǎng)16～20 h，挑選2代單克隆菌種接種于LB培養(yǎng)基內(nèi)，在27℃環(huán)境下?lián)u床培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藤黃微球菌懸液擴(kuò)增至OD600＞0.5時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間適中且抑菌圈直徑大小較易測(cè)量，符合質(zhì)控菌種的要求。細(xì)菌的濃度應(yīng)當(dāng)達(dá)到數(shù)量要求，否則后續(xù)培養(yǎng)時(shí)間會(huì)過(guò)長(zhǎng)，抑菌環(huán)超出最佳數(shù)值范圍。

3.3 雙碟培養(yǎng)基的制備

（1）底層培養(yǎng)基。121℃，30 min高壓滅菌后的培養(yǎng)基，加注底層20 mL，均勻鋪滿平皿且無(wú)氣泡，溫度不應(yīng)過(guò)低，控制在60～70℃，以免培養(yǎng)基在倒板過(guò)程中凝結(jié)成塊而無(wú)法使用。待凝固后進(jìn)行下一步。

（2）菌層培養(yǎng)基。無(wú)菌條件下用微量移液器吸取細(xì)菌懸液適量，加入融化的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)中，制成5 mL菌層。培養(yǎng)后對(duì)最大濃度標(biāo)準(zhǔn)液（106U／L）產(chǎn)生的抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示，菌液和培養(yǎng)基體積之比為1∶50時(shí)，抑菌圈最大直徑處在20 mm左右。菌層制備過(guò)程中培養(yǎng)基溫度會(huì)影響菌層的均勻攤布，有研究證實(shí)［8］，溫度過(guò)低培養(yǎng)基會(huì)提前凝固。室溫25℃左右時(shí)制備菌層，培養(yǎng)基溫度需要滿足以下兩個(gè)條件：①融化的培養(yǎng)基溫度不可超過(guò)50℃，過(guò)高可使細(xì)菌生長(zhǎng)受限甚至導(dǎo)致細(xì)菌死亡而無(wú)抑菌圈；②不可低于45℃，過(guò)低導(dǎo)致菌液與培養(yǎng)基不能混勻，在培養(yǎng)基在底層上攤布不均勻，表面部分凝固、局部凹凸不平，產(chǎn)生的抑菌圈不規(guī)則，誤差增大。所以當(dāng)菌液加入培養(yǎng)基混勻以后，應(yīng)當(dāng)盡快加注到底層培養(yǎng)基上并迅速轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使菌層培養(yǎng)基均勻鋪滿整個(gè)底層培養(yǎng)基，若表面不平整則會(huì)導(dǎo)致樣本從牛津杯下緣流出導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

3.4 加樣的影響因素

盡量使用自動(dòng)放置器按照四象限法放置牛津杯，以使牛津杯之間的距離均等，避免距離過(guò)小導(dǎo)致抑菌圈相連。放置好的牛津杯應(yīng)靜置15 min使其在培養(yǎng)基上沉降穩(wěn)定，再用微量移液器向牛津杯中加樣。加樣量為20 μL時(shí)，可以得到直徑大小較為適中的抑菌圈，且不會(huì)出現(xiàn)牛津杯因?yàn)榧訕恿窟^(guò)多產(chǎn)生位移或者樣品從牛津杯滲出導(dǎo)致抑菌圈模糊的現(xiàn)象。由于不同的樣本中抗生素濃度不一致，加樣量大抑菌圈大，加樣量小抑菌圈小，所以加樣量的多少主要取決于每個(gè)牛津杯中抗生素單位數(shù)，不同的待檢樣本需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定合適的加樣量。加樣過(guò)程中，移液器槍頭吸液不能有氣泡，樣本需一次加樣成功，滴加時(shí)注意加樣方向以及高度，不能掛壁或者漏到牛津杯外緣，最大加樣量不應(yīng)超出牛津杯體積范圍，操作不規(guī)范均會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

3.5 雙碟培養(yǎng)時(shí)間及溫度對(duì)樣品檢定的影響

檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌圈產(chǎn)生效果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)27℃培養(yǎng)6～12 h時(shí)，抑菌圈清晰且最大直徑處于20 mm左右。如果培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抑菌圈會(huì)出現(xiàn)邊界不清、抑菌圈相連難以精確測(cè)量的情況。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，則菌層還未生長(zhǎng)到可觀察的狀態(tài)，細(xì)菌抑制效果不明顯。培養(yǎng)時(shí)間及溫度的確定跟菌層中菌量多少、抗生素效價(jià)有關(guān)，所以在每次實(shí)驗(yàn)前都需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定具體方案，并在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行觀察，在適宜時(shí)間進(jìn)行結(jié)果測(cè)定。

3.6 抑菌圈測(cè)量的影響因素

主要有游標(biāo)卡尺測(cè)量和抑菌圈測(cè)定儀測(cè)量?jī)煞N方法。一般選用儀器測(cè)量以減小人為因素造成的誤差。記錄測(cè)量結(jié)果后進(jìn)行藥物濃度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與應(yīng)用

根據(jù)已經(jīng)確定的實(shí)驗(yàn)條件按步驟操作，測(cè)得青霉素標(biāo)準(zhǔn)液產(chǎn)生的抑菌圈直徑。以樣品中青霉素濃度c（U／L）的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，抑菌圈直徑d（mm）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用Microsoft Excel軟件計(jì)算回歸方程為lg c（U／L）＝0.10 d（mm）＋2.66，R2＝0.996，該方程的線性范圍為102～106U／L。利用已知條件進(jìn)行大鼠血清樣品測(cè)定，可得到邊界清晰、大小適中的抑菌圈。測(cè)得青年大鼠血清青霉素濃度為（4 957.93 ±526.32）U／L，老年大鼠為（41 835.98 ±633.69）U／L（見圖1）。

圖1 青老年大鼠血清樣品中青霉素濃度的測(cè)定結(jié)果

4 教學(xué)實(shí)踐

細(xì)菌的人工培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)是需要學(xué)生掌握的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。教學(xué)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，以往我校開展的實(shí)驗(yàn)課由于經(jīng)濟(jì)、師資、時(shí)間和空間成本的原因，預(yù)實(shí)驗(yàn)通常只由實(shí)驗(yàn)教師完成，課堂上同學(xué)只需劃線接種，學(xué)習(xí)紙片擴(kuò)散法藥敏實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠精確。本研究討論的管碟法是國(guó)際常用的抗生素微生物檢定法之一，針對(duì)管碟法中可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的條件進(jìn)行探討，總結(jié)出了一種完善可靠的實(shí)驗(yàn)條件，并運(yùn)用于教學(xué)實(shí)驗(yàn)中?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)條件，選拔一批對(duì)科研有興趣、學(xué)有余力的同學(xué)［12］，由實(shí)驗(yàn)教師帶領(lǐng)進(jìn)行了如下預(yù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：樣本的制備，青霉素標(biāo)準(zhǔn)液的配制、實(shí)驗(yàn)器材的滅菌、細(xì)菌的培養(yǎng)，雙碟的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。實(shí)驗(yàn)開始前，教師對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的原理以及樣本制作、管碟法的步驟做了介紹，詳細(xì)講解了實(shí)驗(yàn)影響因素以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)。而實(shí)驗(yàn)中以教師指導(dǎo)、學(xué)生自主操作為主要教學(xué)方法。過(guò)程中指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行結(jié)果分析，引導(dǎo)學(xué)生查詢資料，建立不同的疾病模型獲取實(shí)驗(yàn)樣本、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)的各種問(wèn)題的原因［13-14］。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果分析、資料查詢、實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫等使學(xué)生得到系統(tǒng)的鍛煉，如動(dòng)物手術(shù)操作訓(xùn)練、動(dòng)物疾病模型的建立方法、儀器設(shè)備的使用以及細(xì)菌人工培養(yǎng)方法、抗生素的測(cè)定方法等，增強(qiáng)了學(xué)生生物安全以及動(dòng)物倫理知識(shí)（見表1）。綜合以上同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，此實(shí)驗(yàn)方案可行，整個(gè)操作過(guò)程規(guī)范，多組別的樣本制作、標(biāo)準(zhǔn)曲線可用，測(cè)得不同組別的樣本有差異性。

表1 管碟法應(yīng)用于教學(xué)實(shí)踐后的學(xué)習(xí)效果

5 結(jié) 語(yǔ)

傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中細(xì)菌人工培養(yǎng)多采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，教師準(zhǔn)備好菌群供學(xué)生接種，學(xué)生不能完全掌握細(xì)菌人工培養(yǎng)的各種方法，細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)又是醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，應(yīng)當(dāng)為廣大醫(yī)學(xué)生所掌握。本研究建立了一種較為完善可靠的利用微生物管碟法測(cè)定血清青霉素的方法，運(yùn)用于教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，并致力于提高教學(xué)水平，在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。由于實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備周期長(zhǎng)，目前只能讓部分學(xué)有余力，樂(lè)于參與預(yù)實(shí)驗(yàn)的同學(xué)受益，取得較好的教學(xué)效果。未來(lái)借鑒MOOC等先進(jìn)教學(xué)理念［12，15］，將信息化時(shí)代的線上教學(xué)和傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的線下教學(xué)有機(jī)結(jié)合，全面覆蓋到教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，提高教學(xué)水平及效果。