李 欣， 趙玉紅， 石建黨， 趙立青， 李小菊， 張偉英

（南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津300071）

0 引 言

蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting或Immunoblotting）技術(shù)是通過(guò)免疫學(xué)手段，即利用抗原抗體特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)固定在支撐膜上的蛋白質(zhì)，從而對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和半定量分析的一項(xiàng)重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)［1-2］。該技術(shù)將電泳的高分辨率和免疫反應(yīng)的高特異性結(jié)合在一起，有利于在復(fù)雜樣品中對(duì)靶蛋白進(jìn)行檢測(cè)和鑒別，進(jìn)而獲得相應(yīng)細(xì)胞或組織中靶蛋白的表達(dá)水平等相關(guān)信息，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)等諸多研究領(lǐng)域中常用的實(shí)驗(yàn)方法［3-4］。

基于蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)的重要性和實(shí)用性，我校生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心分子生物學(xué)課程組積極嘗試將其引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)，設(shè)置了“免疫印跡法檢測(cè)目的基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)”這一綜合性實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)首先利用SDS-PAGE將菌體樣品中的蛋白分離，再經(jīng)過(guò)電泳轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移至固相支撐膜上，通過(guò)抗體雜交特異性的檢測(cè)菌體中目的蛋白的表達(dá)情況。該實(shí)驗(yàn)的設(shè)置旨在讓學(xué)生能夠緊跟學(xué)科發(fā)展，充分理解并掌握免疫印跡法這一科研領(lǐng)域常用技術(shù)手段，并在教學(xué)實(shí)踐中培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)思維和良好的科學(xué)素養(yǎng)，以便更好地與未來(lái)發(fā)展接軌［5-6］。

1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

Bio-Rad垂直電泳裝置，Bio-Rad Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽，Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽，Bio-Rad PowerPac HC高電流電泳儀，Eppendorf 5418離心機(jī)，金屬浴，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，GeneSys Chemi：XR5凝膠成像系統(tǒng)，磁力攪拌器，搖床等。

2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

分別轉(zhuǎn)化有pGEX-4T-2和pGEX-4T-2／GAPDH質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α，30%丙烯酰胺凝膠貯液，分離膠緩沖液（1.5 mol／L Tris-HCl，pH8.8），濃縮膠緩沖液（0.5 mol／L Tris-HCl，pH6.8），10%SDS，10%AP，TEMED，1×電極緩沖液，2×SDS-PAGE上樣緩沖液，預(yù)染Marker，1×PBS溶液，電轉(zhuǎn)移緩沖液（濕轉(zhuǎn)／半干轉(zhuǎn)），100%甲醇，PVDF 膜，Whatman 3MM 濾紙，PBST，封閉液（5%脫脂奶粉），鼠源抗GST抗體，辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）偶聯(lián)羊抗鼠IgG，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 大腸桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)

（1）菌種培養(yǎng)。將含pGEX-4T-2空載體和pGEX-4T-2／GAPDH重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α分別接種于10 mL含有80 μg／mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r／min 振蕩培養(yǎng)。

（2）誘導(dǎo)培養(yǎng)。至OD600達(dá)0.4～0.6 時(shí)，分裝菌液至細(xì)菌培養(yǎng)管中，每管4 mL，兩種菌液各分2管，其中1管作為對(duì)照，不加IPTG誘導(dǎo)，另外1管加入IPTG至終濃度1 mol／L，20 ℃，200 r／min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

3.2 樣品的制備

（1）收集菌體。在1.5 mL離心管中加入100 μL菌液，12 000 r／min 離心1 min，棄去上清，4 份菌液樣品收集方法相同。

（2）菌體裂解。在4份菌體沉淀中分別加入100 μL PBS溶液，充分混勻后再加入等量2×SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后金屬浴上100℃加熱20 min，并且每隔幾min輕彈盛裝樣品的離心管底部，保證菌體裂解充分。

（3）獲得上樣樣品。菌體裂解液14 000 r／min離心5 min，上清用于上樣。

3.3 SDS-PAGE

（1）制膠。配制12%分離膠和5%濃縮膠。

（2）上樣。預(yù)染Marker 3 μL，樣品8 μL。

（3）電泳。樣品在濃縮膠時(shí)電壓80 V，在分離膠時(shí)120 V。

3.4 電泳轉(zhuǎn)印

（1）根據(jù)Marker條帶將凝膠切成理想大小，剪好同等大小的濾紙和PVDF膜。

（2）將PVDF膜放入100%甲醇中浸泡1～2 min。

（3）將凝膠、濾紙和PVDF膜放入電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。

（4）在Bio-Rad Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽或Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽中組裝“三明治”結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)印槽連接電泳儀，前者4℃ 100 V恒壓轉(zhuǎn)印1 h，后者10 V轉(zhuǎn)印30 min。

3.5 抗體雜交

（1）將PVDF膜置于封閉液中，室溫封閉45 min，PBST洗膜。

（2）孵育鼠源抗GST抗體（1∶5 000 PBST稀釋），室溫孵育1 h，PBST洗膜。

（3）孵育HRP偶聯(lián)羊抗鼠IgG（1∶10 000 PBST稀釋），室溫孵育45 min，PBST洗膜。

3.6 成像檢測(cè)

（1）將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A液和B液1∶1配制，PVDF膜上孵育1 min后棄去。

（2）將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)，CCD成像。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1、2所示是用鼠源抗GST抗體對(duì)4份菌體樣品中的GST（大小約26 kD）和GST-GAPDH（大小約63 kD）蛋白進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。其中圖1是經(jīng)CCD成像的直觀結(jié)果，圖2是利用軟件將發(fā)光條帶與Marker合成后的結(jié)果。

從圖2結(jié)果可見，A和B泳道上出現(xiàn)GST相應(yīng)大小的清晰條帶，C和D泳道上出現(xiàn)GST-GAPDH相應(yīng)大小的清晰條帶，且誘導(dǎo)組（B和D）分別較對(duì)照組（A和C）中目的蛋白表達(dá)量有明顯增加，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。但結(jié)果中尚存在2個(gè)問(wèn)題：①出現(xiàn)非特異性條帶；②沒(méi)有檢測(cè)內(nèi)參（這兩部分內(nèi)容會(huì)在后面的5.4和6.3.4中具體討論）。

圖1 CCD成像結(jié)果

圖2 軟件合成結(jié)果

5 注意事項(xiàng)

5.1 預(yù)染Marker的使用

在Western blotting的SDS-PAGE中，所用的Marker為條帶可見的預(yù)染Marker，其作用是不需要經(jīng)過(guò)染色就可以實(shí)時(shí)觀察電泳進(jìn)度和Marker條帶的分離情況。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟中，它是作為估測(cè)轉(zhuǎn)印效率以及確定最終蛋白條帶大小的重要依據(jù)。

5.2 “三明治”結(jié)構(gòu)的組裝

所謂“三明治”結(jié)構(gòu)，是指在濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)操作過(guò)程中形成的“（負(fù)極）濾紙—凝膠—膜—濾紙（正極）”結(jié)構(gòu)。正確組裝“三明治”結(jié)構(gòu)是將凝膠中的蛋白成功轉(zhuǎn)印于支撐膜上的關(guān)鍵步驟，也是檢驗(yàn)學(xué)生對(duì)電泳轉(zhuǎn)印原理掌握情況的重要標(biāo)準(zhǔn)。組裝三明治結(jié)構(gòu)時(shí)方向切勿裝反，并且需要趕走氣泡，保證三明治結(jié)構(gòu)中各層完全貼合，防止氣泡干擾轉(zhuǎn)印。

5.3 轉(zhuǎn)印條件的確定

轉(zhuǎn)印的電壓和時(shí)間與目的蛋白的大小、所使用的轉(zhuǎn)印方法等因素密切相關(guān)。當(dāng)轉(zhuǎn)印分子量較大的蛋白時(shí)，通常采用濕轉(zhuǎn)，同時(shí)可以適當(dāng)提高電壓或延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間；對(duì)于小分子量蛋白，濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)均可，但切忌電壓過(guò)高或轉(zhuǎn)印時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則小蛋白容易穿透支撐膜而不能有效轉(zhuǎn)印。在轉(zhuǎn)印條件相同的情況下，電壓和時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，如需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間，則可以適當(dāng)降低電壓［7-8］。具體轉(zhuǎn)印條件需要根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容而定。

5.4 雜交中非特異性結(jié)合的降低

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可見非特異性條帶，為盡可能地降低或避免非特異性結(jié)合，通常有以下幾個(gè)方面需要注意：11抗體孵育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，尤其是二抗，抗體孵育時(shí)間越長(zhǎng)，則需要增加洗膜次數(shù)；22抗體孵育后的漂洗需要在搖床上快速搖動(dòng)并多次換液，通常以少量多次的洗膜方式效果更好［9］；33延長(zhǎng)封閉時(shí)間，還可以在封閉液中加入吐溫20。當(dāng)然，抗體本身的質(zhì)量好壞以及稀釋倍數(shù)的高低對(duì)于雜交特異性的影響更是至關(guān)重要，需要在實(shí)踐中不斷摸索和嘗試。

6 教學(xué)實(shí)踐

6.1 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是面向本院生物科學(xué)、生物技術(shù)和伯苓班專業(yè)大三學(xué)生開設(shè)的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)必修課程，教學(xué)內(nèi)容圍繞“小鼠GAPDH基因的克隆與原核表達(dá)”而展開，10項(xiàng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目分別為：從小鼠肝臟中提取RNA，RT-PCR獲得目的基因，目的基因的純化與回收，載體pGEX-4T-2的制備，目的基因／載體的酶切，酶切片段的回收，目的基因與載體的連接，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子的篩選（菌落PCR），目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和PAGE分析。

由此可見，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)在教學(xué)內(nèi)容上環(huán)環(huán)相扣，即上一實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物是下一實(shí)驗(yàn)的材料。整個(gè)實(shí)驗(yàn)是從提取小鼠肝臟RNA開始，逐步構(gòu)建重組DNA分子pGEX-4T-2／GAPDH，并最終通過(guò)IPTG誘導(dǎo)獲得原核表達(dá)。

在目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和PAGE分析實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)轉(zhuǎn)化有pGEX-4T-2空載體和pGEX-4T-2／GAPDH重組質(zhì)粒的菌體進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，全菌樣品利用SDSPAGE結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果

從圖3可見，在B泳道中31kD稍下的位置，出現(xiàn)了相對(duì)A泳道中同樣位置表達(dá)增加的蛋白條帶，理論上應(yīng)為GST蛋白；在D泳道中66.2kD稍下的位置，出現(xiàn)了相對(duì)C泳道中同樣位置表達(dá)增加的蛋白條帶，理論上應(yīng)為GST-GAPDH蛋白。但該方法只是根據(jù)蛋白分子量大小進(jìn)行判斷，并不具有特異性，即使表達(dá)量增加的蛋白大小符合預(yù)期，也無(wú)法完全確定該蛋白就是目的蛋白，這就引發(fā)了學(xué)生對(duì)結(jié)果的質(zhì)疑。

為此，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程組結(jié)合本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)，在原有教學(xué)內(nèi)容的基礎(chǔ)上設(shè)置了“免疫印跡法檢測(cè)目的基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)”這一綜合性實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚺c原有教學(xué)內(nèi)容相互驗(yàn)證、融會(huì)貫通，是對(duì)基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)的必要補(bǔ)充與延伸［11］。

6.2 教學(xué)模式

由于本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容具有較強(qiáng)的連貫性和綜合性，對(duì)學(xué)生的理解能力、操作能力和分析能力都有著較高的要求。而基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課程受眾面廣，學(xué)生水平參差不齊，且一定程度上受到課時(shí)的限制。為不增加學(xué)生的學(xué)習(xí)負(fù)擔(dān)，實(shí)驗(yàn)首先面向?qū)υ搩?nèi)容感興趣并且學(xué)有余力的學(xué)生開設(shè)，即在完成基礎(chǔ)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)后，本著學(xué)生自愿參加的原則，根據(jù)報(bào)名人數(shù)進(jìn)行分組，每組2或3人。教師首先進(jìn)行必要的理論講解、思路引導(dǎo)以及相關(guān)儀器操作示范，每組學(xué)生可自行制定實(shí)驗(yàn)方案，如誘導(dǎo)條件（IP TG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度）、抗體種類（抗GST抗體、抗GAPDH抗體）以及電泳轉(zhuǎn)印方法（濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)）等。在隨后的教學(xué)過(guò)程中，教師只進(jìn)行必要的答疑解惑，學(xué)生可根據(jù)自己的時(shí)間安排實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要求每組學(xué)生對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行匯報(bào)展示，由師生一起對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題及實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行討論與點(diǎn)評(píng)，讓每個(gè)學(xué)生都能從他人的工作中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，吸取教訓(xùn)，取長(zhǎng)補(bǔ)短。這樣的研討式分組教學(xué)模式，既能夠避免教學(xué)中因扎推操作而造成的擁擠現(xiàn)象，大大增加了學(xué)生親自動(dòng)手實(shí)踐的機(jī)會(huì)，更充分突出了學(xué)生的主體地位，調(diào)動(dòng)了學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，對(duì)于培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的綜合實(shí)踐能力起到積極作用［12］。

6.3 教學(xué)探討

6.3.1 兩種轉(zhuǎn)印方法的比較

蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)印通常有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)兩種。二者的原理和過(guò)程基本相同。所不同的是，濕轉(zhuǎn)是將三明治結(jié)構(gòu)全部浸于電轉(zhuǎn)移緩沖液中，而在半干轉(zhuǎn)中只有濾紙起到儲(chǔ)存電轉(zhuǎn)移緩沖液的作用。因此，前者緩沖液用量大，導(dǎo)電能力強(qiáng)，適于長(zhǎng)時(shí)間轉(zhuǎn)印，但需要配備冷卻系統(tǒng)，以分散較長(zhǎng)時(shí)間轉(zhuǎn)印所產(chǎn)生的熱量；而后者其緩沖液用量少，無(wú)需冷卻裝置，使用方便，但緩沖能力有限，所以轉(zhuǎn)印時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，更適于快速轉(zhuǎn)印。由于分子量較大的蛋白在短時(shí)間內(nèi)快速轉(zhuǎn)印的轉(zhuǎn)移效率較低，因此，濕轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)移蛋白分子量范圍要更廣一些［7-8］。本實(shí)驗(yàn)的目的蛋白大小適中，對(duì)于兩種轉(zhuǎn)印方法均適用，因此每組學(xué)生可以自由選擇嘗試，以提高學(xué)生的主觀能動(dòng)性和綜合實(shí)踐能力［13］。

6.3.2 一膜多用

本實(shí)驗(yàn)中pGEX-4T-2空載體表達(dá)GST標(biāo)簽蛋白（大小約26 kD），pGEX-4T-2／GAPDH重組質(zhì)粒表達(dá)GST-GAPDH融合蛋白（大小約63 kD），因此實(shí)驗(yàn)中選用抗GST抗體進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)。值得一提的是，由于編碼GAPDH蛋白的基因來(lái)自小鼠，因此，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，還可以利用膜再生液將膜上的封閉蛋白及抗體除去，經(jīng)再次封閉后選擇鼠源抗GAPDH抗體重新孵育。又或者，在PVDF膜第一次封閉后，根據(jù)膜上Marker大小將膜剪開，分子量較小的部分孵育抗GST抗體，分子量較大的部分既可以孵育抗GST抗體，也可孵育抗GAPDH抗體。學(xué)生可以根據(jù)不同抗體的雜交結(jié)果進(jìn)行討論和分析，在掌握一膜多用的操作方法基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深化對(duì)免疫印跡技術(shù)的理解和認(rèn)知。

6.3.3 檢測(cè)和成像方法的選擇

Western Blotting對(duì)目的蛋白的檢測(cè)方法主要取決于二抗的標(biāo)記類型，不同的標(biāo)記則需要采取不同的方式方法進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)用到的是目前最為常用的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的酶聯(lián)二抗，檢測(cè)方法則選用反應(yīng)速度快、靈敏度高的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL），其原理是辣根過(guò)氧化物酶可以催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物，進(jìn)而可以利用膠片曝光或CCD系統(tǒng)成像。膠片曝光與CCD系統(tǒng)成像相比，前者需要利用膠片在暗室中進(jìn)行時(shí)間梯度的顯影和定影，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣，對(duì)于本科生而言操作難度較大，且相關(guān)試劑因具有一定的毒性還會(huì)給實(shí)驗(yàn)教學(xué)帶來(lái)安全隱患；而CCD成像速度快，操作簡(jiǎn)單安全，無(wú)需耗材成本，不僅具有高靈敏度和高分辨率，還能夠利用軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)量，因此更適于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

6.3.4 上樣量的校正

蛋白免疫印跡法主要用于比較不同條件下目的蛋白的相對(duì)變化，而比較的基礎(chǔ)就是等量的樣品上樣量。目前，最為常用的校正上樣量的方法則是在檢測(cè)目的蛋白的同時(shí)檢測(cè)內(nèi)參。即內(nèi)部參照，通常是指管家基因表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)水平相對(duì)恒定，基本不受環(huán)境因素的影響。內(nèi)參的檢測(cè)不但能夠起到校正上樣量的作用，還可以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)體系是否正確穩(wěn)定，用以排除由于人為等因素給實(shí)驗(yàn)造成的影響。內(nèi)參蛋白的選擇通常要考慮到樣本種屬、與目的蛋白之間的大小差異以及是否有可用抗體等多種因素。本實(shí)驗(yàn)所用材料為大腸桿菌，理論上可選擇其內(nèi)源性的GAPDH作為內(nèi)參，但目前市售的抗體鮮有大腸桿菌來(lái)源，雖有文獻(xiàn)報(bào)道用鼠源抗GAPDH抗體可以代替，但檢測(cè)效果不甚理想，需要對(duì)抗體的稀釋度和曝光時(shí)間等條件進(jìn)一步摸索和優(yōu)化［1-2］。

7 結(jié) 語(yǔ)

將科研領(lǐng)域中常用技術(shù)手段打造成適于本科教學(xué)實(shí)踐的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一直是高校教學(xué)改革的重要方向之一［14-15］。為此，我校生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心分子生物學(xué)課程組開設(shè)了“免疫印跡法檢測(cè)目的基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)”這一綜合性項(xiàng)目作為對(duì)基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)的擴(kuò)展。通過(guò)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和合理的教學(xué)設(shè)計(jì)將蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)，并結(jié)合學(xué)生基礎(chǔ)和教學(xué)實(shí)際，采取研討式分組教學(xué)模式，讓學(xué)生在學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)技能的同時(shí)，有更多獨(dú)立操作與思考的空間，和更多相互交流與借鑒的機(jī)會(huì)，充分發(fā)揮其主觀能動(dòng)性，使學(xué)生的思維方式和實(shí)驗(yàn)素養(yǎng)都能得到嚴(yán)謹(jǐn)性、科學(xué)性和系統(tǒng)性的訓(xùn)練，這也是高校創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的必然要求［16］。